[發明專利]用于分析啟動子活性的載體以及基于RNA計數的啟動子活性分析方法

在審

• 申請號: 201711382250.6
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN108220312A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 李陽;李楊
• 申請（專利權）人: 武漢伯遠生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12Q1/6851
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 俞鴻;馮超

本發明公開了一種用于分析啟動子活性的載體以及基于RNA計數的啟動子活性分析方法，該方法通過在同一個載體上用不同的兩個啟動子Pa和Pb；分別驅動兩個高度相似的DNA序列DNAa和DNAb，體內轉錄后得到RNAa和RNAb，通過計算DNAa?PCR產物DNA和DNAb?PCR產物DNA的數量比，確定Pa對Pb啟動子的活性關系。此方法具有精準定量、抗干擾能力強、快速、不受受體材料和物種限制等特點。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地指一種用于分析啟動子活性的載體以及基于RNA計數的啟動子活性分析方法。

背景技術

隨著全基因組測序技術、分子生物學、生物信息學的快速發展，有大量的基因被測序和克隆，在功能基因研究中，基因啟動子研究分析是主要的組成部分，因而對啟動子的活性研究至關重要。常規植物啟動子活性分析的方法是通過轉基因技術獲得穩定的轉基因株系，使用Gus作為報告基因，通過染色，根據染色深淺判斷啟動子的強度，此類技術實驗周期長(4-6個月)、無法做到精細定量、工作量大、成本高。

目前對動物細胞啟動子活性驗證方法多采用雙熒光素報告系統，該系統使用兩個載體，一個載體上用標準啟動子驅動海腎熒光素酶，另一個載體上用待測啟動子驅動螢火蟲熒光素酶，這兩個酶表達后分別可以利用海腎熒光素和螢火蟲熒光素發出紅色和黃綠色的熒光，通過比較兩種熒光的強度，判斷啟動子的強度，此類技術結果不穩定、不精確，同時對于無法獲得單細胞的組織因不能有效吸收熒光素而無法使用，因而在植物中很少應用。此系統是兩個載體的系統，不能保證進入細胞的兩種載體的比例是嚴格的1：1，這是第一種產生系統誤差的原因；其次，兩種不同的熒光素發光系統，發光效率不一致，用不同的測試底物，各自底物的濃度不好確定，這是第二種產生系統誤差的原因；最后，此系統不是直接評估與啟動子活性直接相關的RNA的數量，而是在蛋白水平評估蛋白活性，從RNA到蛋白翻譯的過程中因為密碼子翻譯效率問題會產生本質的差異，這會給該系統帶來最致命的系統錯誤，而且所用儀器、試劑等成本昂貴。

綜上所述，現有的技術存在系統復雜，不直接，不準確，周期長，或者成本高等弊端。

發明內容

本發明針對現有技術存在缺陷，提供了一種用于分析啟動子活性的載體以及基于RNA計數的啟動子活性分析方法，該方法通過比對啟動子直接產物--RNA的數量評估啟動子活性，該方法的過程直接，不會引入系統誤差。

為實現上述目的，本發明提供的一種用于分析啟動子活性的載體，所述載體的骨架上設置有兩個轉錄單元，分別為轉錄單元A與轉錄單元B，所述轉錄單元A包括待比較的參考啟動子Pa、DNAa序列和終止子；所述轉錄單元B包括待比較的目標啟動子Pb、DNAb序列和終止子；其中，所述DNAa序列和DNAb序列來源于同一序列，且DNAa和DNAb之間的個別堿基存在差異。

進一步地，所述DNAa序列和DNAb序列均為任意的序列或完整的ORF，所述DNAa序列和DNAb序列優選為完整的ORF，尤其優選常見的報告基因如Gus、Gfp等報告基因。

再進一步地，所述載體為pARC-gfp載體，序列為SEQ ID No.1所示，其中，

它包括以Gfp基因上的一段序列作為DNAa、DNAb序列，分別如SEQ ID No.2和SEQID No.3所示，其具體序列如下：

DNAa：

5’-TTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACGCGAGCTGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACGCTCGTCAACCGTATCGAGCTCAAGGGAATCGACTTCAAGGAGGACGGAAACATTCTCGGACACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCCCACAACGTTTACATAATGGCGGACAAGCAGAAGAACGGCATTAAGGCCAACTT-3’；

DNAb：