[發明專利]聚乙二醇定點修飾的精氨酸脫亞胺酶及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201711379689.3
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN108265044B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 馬永;王俊;張鵬成
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;A61K38/50;A61P35/00;A61P35/02
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• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種聚乙二醇定點修飾的精氨酸脫亞胺酶及其制備方法與應用，所述聚乙二醇在ADI的1或2個亞基的N端氨基上偶聯，所述聚乙二醇分子量為30?40kDa，聚乙二醇為分支型。本發明提供的聚乙二醇定點修飾的ADI，在具有結構穩定均一等優點的基礎上，更大程度的提高了其生物活性。并且，本發明所采用的ADI為基因工程重組表達得到，質量更可控，來源更有保障。這些都使得本發明中的聚乙二醇定點修飾的ADI各方面效果優于目前市場上同類產品，因此本發明的聚乙二醇定點修飾的ADI更具有藥用前景及產業化生產可能性。

技術領域

本發明涉及聚乙二醇修飾的蛋白類藥物，特別是聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶及其制備方法和其在藥物制備中的應用。

背景技術

精氨酸是人體的一種非必需氨基酸，可以經尿素循環獲得，而精氨酸缺陷型腫瘤因缺少ASS(Argininosuccinate Synthetase)所以細胞無法合成精氨酸，因此其生長需要從外部環境中攝取精氨酸。經研究表明，精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,EC3.5.3.6，簡稱ADI)能夠降解環境中的精氨酸，從而抑制這些精氨酸缺陷型腫瘤的生長，達到殺死癌細胞治療癌癥的目的。這種新型的“精氨酸剝奪療法”可以用于某些精氨酸營養缺陷型癌細胞的治療，例如肝癌細胞和黑素瘤細胞。

ADI廣泛存在于細菌和真核細胞內，自從1933年F.Horn首次報道了綠膿假單胞菌(Pesudomonas pyocyaneum)中含有ADI后，之后很多來源于不同微生物的ADI相繼被報道，包括假單胞菌、支原體、鹽桿菌和乳球菌等。來源于不同微生物的ADI在酶活及性質方面差別較大，最適反應pH范圍在5.6到7.6之間，大多數在酸性范圍內；分子量范圍從47kDa到199kDa，多為同源二聚體，部分為同源四聚體；比酶活范圍從5.4到140.27U/mg。

自1990年日本和美國的研究機構和公司開始對ADI的抗腫瘤活性進行研究后，ADI作為有效的抗腫瘤藥物目前己經進入到臨床研究階段。但ADI的體內半衰期較短，僅為4h左右，美國肯塔基大學和鳳凰制藥公司的研究人員采用聚乙二醇(SS PEG₂₀₀₀₀)對來源于支原體的ADI進行化學修飾，隨后進行體內外抗腫瘤活性試驗，成功延長了ADI在小鼠體內的半衰期，并且經過ADI-SS PEG₂₀₀₀₀治療后，荷瘤小鼠的存活率得到了極大的提高。2009年，美國鳳凰公司與北極星集團合作研發了標靶藥物ADI-PEG-20，但ADI-PEG-20產品中所使用的PEG是琥珀酰亞胺琥珀酸酯(SS-PEG)，修飾產物不均一，活性損失較大，含有對酶水解敏感的或者在微堿性PH值時不穩定的酯鍵(美國專利號4670417)。這些性質顯著降低了ADI-PEG-20產品體外和體內的穩定性并且副作用也較大。

目前針對ADI的聚乙二醇修飾研究也有很多。但大部分采用的是PEG對ADI進行隨機修飾，修飾ADI賴氨酸殘基上的氨基，因此修飾產物不均一，活性損失較大。為了提高修飾產物的活性，有人采用添加保護劑的方法，讓保護劑先和ADI的活性中心結合，然后再進行PEG修飾，修飾后再去除結合的保護劑，這種方法制備得到的修飾產物，雖然活性保留較好，但操作步驟繁瑣，不適合產業化放大。

發明內容

解決的技術問題：為了克服現有技術中的上述技術問題，本發明旨在提供穩定性提高、免疫原性降低、組分均一的基礎上，也具有高活性的聚乙二醇定點修飾的ADI。

更進一步的說：

本發明的第一目的是提供聚乙二醇定點修飾的ADI，所述聚乙二醇在ADI的1或2個亞基的N端氨基上偶聯，所述聚乙二醇分子量為30-40kDa，聚乙二醇為分支型。

優選的，所述聚乙二醇在ADI的2個亞基的N端伯氨基上偶聯。

優選的，所述聚乙二醇分子量為30kDa或40kDa。更優選的，所述聚乙二醇優選分子量40KDa。

優選的，聚乙二醇活化基團為醛基。更優選的，活化基團為乙醛、丙醛、丁醛或戊醛。