[發明專利]一種葡甘聚糖酶編碼基因及酶和制備與應用

有效

• 申請號: 201711379488.3
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN109929861B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 尹恒;李悝悝;王文霞;李倩
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/24;C12N15/63;C12P19/14;C12P19/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明公開了一種來源于產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)的葡甘聚糖酶基因及其酶的制備方法與應用，即利用基因工程的技術方法，將該葡甘聚糖酶的基因克隆到大腸桿菌表達載體上，獲得可異源表達該酶的大腸桿菌重組菌株，該菌株異源表達制備的葡甘聚糖酶，能高效降解魔芋多糖(又稱魔芋葡甘聚糖)。本發明提供的葡甘聚糖酶可廣泛應用于農業、食品、飼料添加劑、醫藥及葡甘露低聚糖制備等領域。

技術領域

本發明涉及一種葡甘聚糖酶的基因序列及其制備方法和應用。本發明提供了 該葡甘聚糖酶的重組質粒和重組基因工程菌株及其在多糖降解方面的應用。本發 明提供的葡甘聚糖酶可廣泛應用于農業、食品、飼料添加、醫藥及寡糖制備等領 域。

背景技術

蒟蒻(Amorphophallus konjac)，俗稱魔芋，天南星科魔芋屬多年生草本植 物。魔芋中主要成分為魔芋多糖(又稱魔芋葡甘露聚糖)，由葡萄糖與甘露糖組 成。魔芋葡甘露聚糖通過β-1,4吡喃糖苷鍵將β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖按1∶1.6 或1∶1.69的摩爾比連接而成，每19個糖殘基上有一個乙酰基團存在，其特殊 的結構使其雖具有多種生物學功能。但是其在水中為膠體，粘度大、溶解度小， 在后續加工利用上帶來不便；其在各種食品中添加量小，影響了其生物活性。目 前我國魔芋產業多停留在魔芋初級食品開發層面，亟需高值化加工技術，對魔芋 主要成分魔芋葡甘露聚糖的深加工是魔芋下游產業的主要方向。

將魔芋多糖降解成魔芋寡糖，即魔芋葡甘露寡糖(Konjac oligo-glucomannan，KOGM)，其分子量小，在水中可溶，易于吸收，將會克服魔芋多糖在加工利用 中問題。與魔芋多糖相比，魔芋寡糖具有優良的性能，具有改善食品品質，保鮮 食品，改善人體腸道菌群，增強免疫力，調節血糖、血脂以及腸道解毒等生物活 性。生理功能試驗表明，葡甘露低聚糖除了具有低熱量、穩定、安全無毒等良好 的理化特性外，還具有促進以雙歧桿菌為代表的有益菌群的增殖,改善腸道內菌 群結構；減慢腸道粘膜分泌的β-糖苷酶的擴散速度，不升高血糖，提高機體抗氧 化能力等功能。

目前尚無大量工業生產魔芋葡甘低聚糖的報道，其生產尚停留在實驗室研究 期間，獲得葡甘低聚糖的方法主要有以下幾種：(1)從天然原料(魔芋)中提 取，但提取工藝復雜，且產率極低；(2)通過人工化學合成的方法獲得，但此 法步驟繁瑣，成本太高；(3)利用酸水解魔芋葡甘露聚糖的方法獲得，但這樣 生產的低聚糖性質不穩定，副產品多，不易得到特定的低聚糖；(4)利用物理 方法降解得到，但此方法要利用現代化的生產設備，實驗設備要求太高，不利于 大量生產；(5)利用酶解葡甘露聚糖的方法獲得，酶的反應效率高，方法簡單、 易控制，后期分離也容易，且酶作為一種生物制劑，不會帶來化學試劑產生的不利因素。所以利用酶解葡甘露聚糖的方法生產葡甘露低聚糖是一條相對簡單，容 易研究的生產方法。

葡甘聚糖酶(glucomannanase)是一種能夠將葡甘聚糖降解為葡甘低聚糖的 酶，根據葡甘聚糖的結構，一般分為兩類：葡聚糖酶和甘露聚糖酶，大部分研究 報道的是葡甘聚糖酶的類似酶——甘露聚糖酶。β-1,4-D-甘露聚糖水解酶 (β-1,4-D-mannanmannohydrolase，EC 3.2.1.78)是一類從甘露聚糖、葡甘露聚糖、 半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的主鏈內部隨機切割β-1,4-D-甘露聚糖糖苷鍵的 水解酶，簡稱β-甘露聚糖酶(β-mannanase)，是降解葡甘露聚糖制備葡甘露寡糖的 有效工具。國內外對甘露聚糖酶的研究多集中于微生物，其中細菌特別是革蘭氏 陽性菌包括芽孢桿菌(Bacillus)和梭菌(Clostridium)，真菌中曲霉(Aspergillus) 和里氏木霉(Trichoderma reesei)，放線菌中鏈霉菌(Streptomyces)研究較多， 但是來源于產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)中的葡甘聚糖酶鮮有報道(僅有四 篇被報道)。目前已報道的葡甘聚糖酶對魔芋多糖的降解活性均較弱，不適于大 規模應用。因此，尋找一種能夠高效、穩定降解魔芋多糖的甘露聚糖酶是降低葡 甘露寡糖生產成本的有利途徑。而由于葡甘露聚糖酶在生物體內的含量非常少，借助基因水平進行高量表達和表征是提高葡甘露聚糖酶產量的一種有效措施。

發明內容