[發明專利]一種兩步法建立間充質干細胞軟骨分化后骨關節炎樣細胞模型的方法

有效

• 申請號: 201711378098.4
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN108048394B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 汪暉;陳廖斌;齊勇建;楊旭;何波
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種胎源性骨關節炎樣細胞模型，其特征在于，所述細胞模型由以下方法構建，包括如下步驟：

1）建立臍帶Wharton 膠來源的間充質干細胞軟骨細胞定向分化模型：將第3代臍帶Wharton 膠來源的間充質干細胞傳代，以海藻酸鈉微球作為生物支架對第4代間充質干細胞進行三維培養，微球制備完成后，以普通完全培養基培養24小時，然后加入軟骨分化培養基進行誘導分化，在體外37℃、濕度95%、CO₂濃度5%的細胞培養箱內培養21天，其間隔天更換軟骨分化培養基一次，將間充質干細胞向軟骨定向分化，獲得軟骨細胞；其中，軟骨分化培養基的成分為：95%DMEM/F12培養基、5%Gibco小牛血清、1%100×ITS、100 nM地塞米松、10ng/mL TGFβ1、40 μg/mL脯氨酸、50 μg/mL抗壞血酸、100 mg/L丙酮酸和10%青鏈霉素；

2）使用含10 ng/ml重組人IL-1β的DMEM/F12培養基處理步驟1）定向分化后的細胞24小時，進行骨關節炎造模；

3）模型的評估：如果檢測到步驟2）建立的細胞模型中軟骨表型基因aggrecan、Col2α1的表達顯著下降、基質降解相關基因MMP3、MMP13、ADAMTS3的表達顯著增加以及阿利新藍、番紅O染色變淺，則該模型建立成功；

步驟3）中軟骨表型基因aggrecan檢測所用的引物對的序列如SEQ ID NO：1-2所示，Col2α1表達的檢測所用引物對的序列如SEQ ID NO：3-4所示，基質降解相關基因MMP3表達的檢測所用引物對的序列如SEQ ID NO：11-12所示，MMP13表達的檢測所用引物對的序列如SEQ ID NO：13-14所示，ADAMTS3表達的檢測所用引物對的序列如SEQ ID NO：15-16所示。

2.權利要求1所述的胎源性骨關節炎樣細胞模型的用途，其特征在于，將該模型用于篩選或鑒定宮內環境干擾物或治療胎源性骨關節炎的藥物。

3.權利要求1所述的胎源性骨關節炎樣細胞模型的用途，其特征在于，將該模型用于制備對胎源性成年骨關節炎易感的早期預警檢測產品。