[發(fā)明專(zhuān)利]一種胰蛋白酶的提取方法及含有胰蛋白酶的原料藥

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711377953.X
• 申請(qǐng)日: 2017-12-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108004222B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顧會(huì)軍;丁嘯嘯;曹植木;王科杰;羅斌斌
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江豐安生物制藥有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/76
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/76;A61K38/48;A61K47/24;A61K47/02;A61K47/10
• 代理公司: 北京維正專(zhuān)利代理有限公司 11508
• 代理人: 邢永

1.一種胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，包括有如下步驟：

步驟一：將動(dòng)物胰臟預(yù)處理去除結(jié)締組織和脂肪，切塊攪碎，得到胰糜；

步驟二：將胰糜加入到提取罐中加乙酸酸化水至浸沒(méi)胰糜，攪拌混合后，得到胰糜-水混合物；

步驟三：將胰糜-水混合物離心至分層，并對(duì)沉淀進(jìn)行壓濾，將壓濾得到的清液與離心得到的上清液混合后得到胰臟提取液；

步驟四：對(duì)胰臟提取液進(jìn)行超濾濃縮后，分別加入30g/L（NH₄）₂SO₄溶液、60g/L（NH₄）₂SO₄溶液、飽和（NH₄）₂SO₄溶液和固體（NH₄）₂SO₄進(jìn)行梯度鹽析，得到胰酶混合物；

步驟五：將胰酶混合物經(jīng)過(guò)壓濾后取濾餅，均勻向?yàn)V餅中加入0.1mol/L CaCl₂溶液至濾餅完全溶解，通過(guò)5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，過(guò)濾去除沉淀后加入胰蛋白酶晶體進(jìn)行激活，得到胰酶粗提液；

步驟六：將胰酶粗提液壓濾后取上清液再次超濾濃縮，得到胰酶濃縮液；

步驟七：活化Sepharose 4B并與雞卵粘蛋白偶聯(lián)，將Sepharose 4B-雞卵粘蛋白混合物裝柱，并通過(guò)Tris-HCl緩沖液平衡；

步驟八：將胰酶濃縮液過(guò)柱去除雜蛋白，用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脫，收集位于洗脫峰的流出液，得到胰蛋白酶精提液；

步驟九：將胰蛋白酶精提液脫鹽過(guò)濾后，凍干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制劑；

步驟一中對(duì)胰臟的預(yù)處理包括有如下步驟：

Step1，剝除胰臟的脂肪和結(jié)締組織后，將胰臟切割成塊；

Step2，通過(guò)絞肉機(jī)將胰臟塊絞成糜狀的胰碎；

Step3，將胰碎浸沒(méi)在堿性脫脂劑中，攪拌脫脂；

Step4，濾去堿性脫脂劑后，用pH=3.0的乙酸酸化水沖洗2~3次，得到胰糜；

所述堿性脫脂劑包括有占?jí)A性脫脂劑總含量0.5mol/L的磷酸三鈉、1mol/L的丙酮、1mol/L的乙酸乙酯和0.05mol/L的氯化鈣。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，步驟七中Sepharose4B的活化包括如下步驟：

Step1，將Sepharose 4B用1mol/L NaCl溶液濾洗2~5次，再用去離子水沖洗1~2次，凍干成粉狀；

Step2，將1.5mL環(huán)氧氯丙烷、6.5mL 2mol/L NaOH溶液、7mL去離子水、9mL二甲基亞砜混合配制活化液，將活化液水浴加熱至40℃；

Step3，將Sepharose 4B干粉加入到活化液中，水浴狀態(tài)下攪拌1.5h；

Step4，抽濾除去 活化液，得活化Sepharose 4B。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，步驟七中Sepharose4B與雞卵粘蛋白偶聯(lián)包括有如下步驟：

Step1，將pH9.5的Na₂CO₃緩沖液在40℃水浴中水浴加熱；

Step2，至Na₂CO₃緩沖液溫度恒定后，加入雞卵粘蛋白至混合均勻；

Step3，將活化Sepharose 4B邊攪拌邊加入到雞卵粘蛋白-Na₂CO₃混合液中，持續(xù)攪拌24h；

Step4，過(guò)濾除清液，完成Sepharose 4B與雞卵粘蛋白的偶聯(lián)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，步驟七的Tris-HCl緩沖液的pH為8.0。