[發明專利]一種讓一化性品種家蠶產非滯育卵的siRNA、制備方法及應用

有效

• 申請號: 201711374286.X
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN108048464B
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發明（設計）人: 時連根;沈張飛;蔣學;費建明
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;A01K67/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

本發明公開了一種讓一化性品種家蠶產非滯育卵的siRNA、制備方法及應用。從化蛹第3天的雌蠶蛹卵巢中提取總RNA，逆轉錄獲得第1鏈cDNA，并RT?PCR擴增克隆獲得Bm.DHR cDNA；以Bm.DHR cDNA為模板PCR擴增，酶切后將DNA片段連接載體獲得pFLAG?Bm.DHR，再PCR擴增獲得反應模板，將反應模板進一步處理得到Bm.DHR siRNA；將Bm.DHR siRNA液過濾膜除菌，注射入每代均產滯育卵的一化性品種家蠶化蛹后2?3天的雌蠶蛹腹部，化蛾后正常交配，產下非滯育卵。本發明讓一化性品種家蠶產非滯育卵，對于研究家蠶胚胎滯育機制、進一步利用家蠶胚胎滯育進行傳統養蠶業的技術革新與經濟效益提高等，具有積極作用。

技術領域

本發明涉及了一種讓一化性品種家蠶產非滯育卵的siRNA、制備方法及應用。

背景技術

滯育(Diapause)是昆蟲在個體發育的某個特定階段主動停止發育的一種現象，它作為一種遺傳特性，在昆蟲的生存、進化、繁榮等中發揮著重要的作用。家蠶(Bombyx mori)為卵滯育型，一化性(univoltine)品種蠶每代都產滯育卵。滯育卵需要經過長時間低溫處理等才能解除其滯育，這給一年多次養蠶帶來不便。所以對家蠶滯育現象的研究，一直為人們所關注。

蠶卵是否發生滯育，主要取決于蛹期由咽下神經節(Subpharyngeal ganglion，SG)合成和分泌的滯育激素(Diapause hormone，DH)作用。當合成和分泌的DH作用于卵巢和發育中蠶卵，引起多種基因表達上調，從而改變蠶卵內的物質代謝，成為滯育卵。家蠶DH的作用是通過家蠶滯育激素受體(Bm.DHR)來介導的，但有關Bm.DHR介導DH作用，來調控家蠶卵滯育等，均缺乏研究。

發明內容

為了解決背景技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種讓一化性品種家蠶產非滯育卵的siRNA、制備方法及應用，是采用RT-PCR克隆，PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳回收，與哺乳動物表達載體pFlag-CMV-3連接，與T7反應緩沖液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合反應，再給雌蠶蛹腹部注射的方法，通過調控家蠶滯育激素作用，讓一化性品種家蠶產非滯育卵。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明保護一種讓一化性品種家蠶產非滯育卵的siRNA，所述siRNA采用以下方法制備而成：

1)解剖并收集化蛹第3天的雌蠶蛹卵巢，從中提取總RNA，然后逆轉錄獲得第1鏈cDNA；

2)以第1鏈cDNA為模板，通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增，克隆獲得Bm.DHR cDNA(家蠶滯育激素受體cDNA)；

3)以Bm.DHR cDNA為模板，通過PCR擴增得到Bm.DHR DNA片段并用瓊脂糖凝膠電泳回收，將Bm.DHR DNA片段用HindIII/BamHI酶切，然后將酶切片段與哺乳動物表達載體pFlag-CMV-3連接獲得pFLAG-Bm.DHR；

4)以pFLAG-Bm.DHR為模板，通過PCR擴增得到pFLAG-Bm.DHR DNA片段并用瓊脂糖凝膠電泳回收，得到純化的大小為1311bp的目的DNA片段，作為反應模板；

5)將反應模板與10×T7反應緩沖液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合進行反應，然后再進行后續處理得到Bm.DHR siRNA，作為所述siRNA。

所述步驟1)具體為：解剖并收集化蛹第3天的雌蠶蛹卵巢，使用Trizol試劑盒提取總RNA，再用逆轉錄第1鏈cDNA合成試劑對總RNA進行逆轉錄獲得第1鏈cDNA，逆轉錄條件是：30℃變性10min，50℃反應60min，95℃滅活5min。

Trizol試劑盒來源于加拿大Bio Basic Inc公司；逆轉錄第1鏈cDNA合成試劑來源于美國Promega公司。