[發明專利]一種用于miRNA干擾載體構建篩選特異對照的質粒及其構建方法

在審

• 申請號: 201711372777.0
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN108384803A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 冼學進
• 申請（專利權）人: 上海百力格生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于miRNA干擾載體構建篩選特異對照的質粒，其特征在于：所述質粒miRNA序列與人源、小鼠和大鼠數據庫中已公布的序列不存在同源，所述質粒作為人源、小鼠和大鼠miRNA干擾的對照組實驗，有較準確的對照參照組實驗意義，所述質粒含有經過特異篩選的目標序列，目標序列為CCTAGGTTAAGTCGCCCTCGT。

2.根據權利要求1所述的一種用于miRNA干擾載體構建篩選特異對照的質粒，其特征在于：所述質粒轉錄出的miRNA不對人源、小鼠和大鼠的蛋白表達起正調控或者負調控作用，是實驗組的miRNA干擾作用能較明顯的做出判斷，從而篩選到理想的miRNA。

3.根據權利要求1或2所述的一種用于miRNA干擾載體構建篩選特異對照的質粒，其特征在于：miRNA干擾載體表達出的miRNA具有經過基因工程改良的骨架結構，其中靶向結合序列進一步剪切成熟后結合目標基因miRNA發揮干擾作用。

4.根據權利要求1或2所述的一種用于miRNA干擾載體構建篩選特異對照的質粒，其特征在于：所述質粒針對靶基因miRNA的干擾載體，在轉染效率>80％的前提下，對實驗中的轉錄水平無明顯干擾作用。

5.根據權利要求1所述的一種用于miRNA干擾載體構建篩選特異對照的質粒的構建方法，其特征在于：所述構建方法包括如下步驟：

（1）預測一段21bp的序列，對人源、小鼠和大鼠的數據庫用局部序列比對基本檢索工具blast進行比對檢索，找到大于90％特異與人源、小鼠和大鼠數據庫的序列；

（2）篩選到預測的21bp序列進行合成構建，載體骨架選用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體；

（3）構建好質粒后進行轉錄后水平表達測試，細胞系選用較常規的HEK293進行干擾實驗；

（4）收集細胞株進行Qpcr檢測，檢測結果顯示對人源、小鼠和大鼠的目標蛋白無明顯干擾作用，目標蛋白正常表達。