[發(fā)明專利]內(nèi)切葡聚糖酶、其編碼基因cel5A-h15及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2017-12-18
• 公開（公告）號: CN107974440B
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王佳堃;何波;金舒文;高歌;李嘉秋
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/11;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 嘉興永航專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33265
• 代理人: 侯蘭玉

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種內(nèi)切葡聚糖酶、其編碼基因cel5A?h15及其應(yīng)用。一種編碼所述內(nèi)切葡聚糖酶的基因cel5A?h15，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼的內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶第5家族。發(fā)明人通過設(shè)計(jì)引物成功將其克隆，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，經(jīng)誘導(dǎo)超聲純化所得的重組內(nèi)切葡聚糖酶的最適作用pH為6.0，最適溫度為50°C，在40°C下能保持較穩(wěn)定的酶活性。該酶具有較強(qiáng)的pH耐受性，在pH5.0?10.0下能保持70%以上的酶活性。該重組內(nèi)切葡聚糖酶具有較大的研究和工業(yè)應(yīng)用潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種內(nèi)切葡聚糖酶、其編碼基因cel5A-h15及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

纖維素作為植物細(xì)胞壁的主要組成成分，是目前自然界中最豐富的可再生資源，然而其頑固的結(jié)構(gòu)限制了它的利用。纖維素降解成葡萄糖的過程需要內(nèi)切葡聚糖酶(Endoglucanase，EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，E.C.3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，E.C.3.2.1.21)三種纖維素酶的系統(tǒng)同作用。其中，內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素酶系最主要的成分，它主要作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解纖維素鏈中的β-1,4糖苷鍵，切斷纖維素長鏈，轉(zhuǎn)化為大量不同聚合度的短鏈，降低纖維素的聚合度，在降解過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。因此，它的生產(chǎn)利用對于纖維素的降解效率至關(guān)重要。目前，該酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于造紙、紡織、食品、生物燃料、動物飼養(yǎng)等行業(yè)中。這些產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用需要生產(chǎn)成本低，具有不同的最適pH和溫度，以及較好穩(wěn)定性的內(nèi)切葡聚糖酶。過去幾十年，大量的研究集中在如何減少真菌生產(chǎn)纖維素酶的成本，主要包括菌的隨機(jī)誘變、工業(yè)優(yōu)化、外源蛋白添加等方法。然而，由于缺乏對復(fù)雜酶系和產(chǎn)酶菌的充分了解，這一進(jìn)程相當(dāng)緩慢。因此，尋找大量新型的內(nèi)切葡聚糖酶尤為重要。

隨著組學(xué)的出現(xiàn)，一些產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶的微生物基因組測序陸續(xù)完成，為進(jìn)一步的研究提供了清晰的遺傳背景，越來越多的纖維素酶基因核苷酸序列得以確定，并在大腸桿菌和酵母中得到了表達(dá)，有效地補(bǔ)充了傳統(tǒng)的酶系統(tǒng)。而轉(zhuǎn)錄組測序能夠提供基因cDNA序列和基因的表達(dá)水平，能夠真實(shí)反映蛋白在體內(nèi)的表達(dá)情況，因此，從環(huán)境微生物轉(zhuǎn)錄組信息中發(fā)掘內(nèi)切葡聚糖酶基因是比較新穎，同時也是行之有效的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種新型的內(nèi)切葡聚糖酶基因cel5-h15，其原核表達(dá)后重組酶Cel5-H15為嗜中溫酶，40℃下能保持穩(wěn)定的酶活性；最適反應(yīng)pH為6.0，最適反應(yīng)溫度為50℃；具有較強(qiáng)的pH耐受性，在pH5.0-10.0下能保持較高活性。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種內(nèi)切葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一種編碼所述內(nèi)切葡聚糖酶的內(nèi)切葡聚糖酶基因cel5A-h15，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶基因cel5A-h15來自湖羊瘤胃微生物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

一種包含所述內(nèi)切葡聚糖酶基因cel5A-h15的重組載體。

一種包含所述木聚糖酶基因cel5A-h15的重組菌。

一種制備內(nèi)切葡聚糖酶的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)所述的重組菌，得到內(nèi)切葡聚糖酶。

擴(kuò)增所述內(nèi)切葡聚糖酶基因cel5A-h15采用的特異性引物，所述的特異性引物為：H15-F：5’ACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGAGCAAAAATGCAAAAATAGCTG 3’，其核苷酸序列如SEQID No.3所示；H15-R：5’CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTAATAGTTTCCGAATGAGTCGAAAAC 3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。