[發明專利]一種富集提取循環腫瘤DNA的方法

在審

• 申請號: 201711366365.6
• 申請日: 2017-12-18
• 公開（公告）號: CN109932224A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 梁鑫淼;李秀玲;張小菲
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

1.一種富集提取循環腫瘤DNA的方法，其特征在于采用柱固相萃取模式，具體步驟如下：

1)將循環腫瘤DNA富集材料裝入移液槍槍頭或者凝膠上樣吸頭中，形成微固相萃取柱，采用洗脫液和上樣液活化及平衡微固相萃取柱，將生物樣品溶解于上樣液中，并上到微固相萃取柱上，循環腫瘤DNA富集材料與生物樣品的質量比為100～1000:1；

2)采用5-200倍柱體積的淋洗液沖洗萃取柱，淋洗液pH 0-7；

3)采用5-100倍柱體積的洗脫液洗脫得循環腫瘤DNA，洗脫液pH 10-12；

上述整個過程在10-60℃進行；

所述循環腫瘤DNA富集材料為雙組分聚合物功能化材料。

2.根據權利要求1所述富集提取循環腫瘤DNA的方法，其特征在于所述雙組分聚合物功能化材料，其結構如下：

其中R為羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基或氫；X＝0.01-0.5；

所述雙組分聚合物功能化材料基底的材料為Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一種或者兩種以上任意比例的混合。

3.根據權利要求1所述的富集提取循環腫瘤DNA的方法，其特征在于所述雙組分聚合物功能化材料的制備方法為：利用原子轉移自由基聚合反應機制，將雙組分功能共聚物接枝到無機半導體、金屬或金屬氧化物表面上，獲得智能響應性聚合物功能表面；所述的無機半導體為Si或SiO₂，所述的金屬為Au、Ag或Pt，金屬氧化物為CuO、Al₂O₃、TiO2、ZrO₂或Fe₃O₄。

4.根據權利要求3所述的富集提取循環腫瘤DNA的方法，其特征在于所述雙組分聚合物功能化材料的制備方法具體為：在25mL的燒瓶中依次加入0.4mmol異丙基丙烯酰胺，0.1mmol的硫脲功能單體，二者摩爾比為4：1，同時加入6mL H₂O以及6mL DMF作溶劑；在攪拌下通入氮氣，待單體充分溶解之后，在氮氣保護下加入催化劑CuBr 0.032g以及PMDETA或聯吡啶配體0.16mL，隨后反應體系抽真空—充氮氣，除去反應體系中殘余的氧氣；將溴化處理過的Si,、SiO₂、Au、Ag、Pt、CuO、Al₂O₃、TiO2、ZrO₂或Fe₃O₄中的任意一種或者兩種以上任意比例的混合物浸入配置好的反應溶液；將燒瓶的溫度控制在60℃靜置反應4～6小時；反應結束后用DMF，H₂O依次洗滌聚合物接枝表面，得到雙組分共聚物；此雙組分共聚物的功能化表面的厚度為10-50nm，氮氣吹干表面后置于真空干燥器中備用。

5.根據權利要求4所述的富集提取循環腫瘤DNA的方法，其特征在于所述硫脲功能單體結構式為：

6.根據權利要求1所述的富集提取循環腫瘤DNA的方法，其特征在于所述雙組分聚合物功能化材料材料的粒徑是0.2-50μm,孔徑為

7.根據權利要求1所述的富集提取循環腫瘤DNA的方法，其特征在于所述生物樣品為血液、滑膜液、腦脊液或尿液。

8.根據權利要求1所述的富集提取循環腫瘤DNA的方法，其特征在于所述上樣液為有機溶劑、有機酸和水的混合液，有機溶劑為乙腈、甲醇或乙醇；有機酸為甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述上樣液中有機溶劑體積為10-50％，pH0-7。