[發明專利]誘導型酵母轉化重組系統的構建及其應用

有效

• 申請號: 201711364673.5
• 申請日: 2017-12-18
• 公開（公告）號: CN108060175B
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 汪洋;蘇會娟
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/64;C12N15/66;C12R1/865
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 劉海霞

1.重組載體pSHTB10，其特征在于，為將質粒pSH-SceI中的colE1、Amp^R和P_Gal1基因元件替換成pSWB中的oriV、trfA和Ble^RDNA片段和Gal1-V10 DNA合成片段，形成全長序列為SEQID NO.32的質粒pSHTB10；所述的質粒pSH-SceI是將質粒pSH47中的Cre元件替換成I-SceI基因片段；所述的質粒pSWB是將質粒pDGICZ中的P_hbs-Ble^R基因元件插入到質粒pSW-2中。

2.基于如權利要求1所述的重組載體pSHTB10的iTAR載體，其特征在于，為將質粒pSHTB10用限制性內切酶FspI酶切，通過在酶切位點處插入與目標線性大片段DNA兩端具有同源性的兩個同源臂并在同源臂間插入I-SceI酶切位點構建而成。

3.如權利要求2所述的iTAR載體，其特征在于，所述的iTAR載體為pSHTB10-HR12，為將pSHTB10用限制性內切酶FspI酶切，在該酶切位點處插入同源臂HR1、同源臂HR2和同源臂間的I-SceI酶切位點，形成全長序列為SEQ ID NO.33的iTAR載體pSHTB10-HR12。

4.如權利要求2所述的iTAR載體，其特征在于，所述的iTAR載體為pSHTB10-HR34，為將pSHTB10用限制性內切酶FspI酶切，在該酶切位點處插入同源臂HR3、同源臂HR4和同源臂間的I-SceI酶切位點，形成全長序列為SEQ ID NO.34的iTAR載體pSHTB10-HR34。

5.如權利要求1所述的重組載體pSHTB10的構建方法，其特征在于，包括引物設計、基因克隆和載體構建，具體為通過合成Gal1-V10基因片段，設計引物從質粒pSWB上PCR擴增oriV、trfA和Ble^R目標片段，限制性內切酶PmlI和SacI酶切質粒pSH-SceI，將Gal1-V10、oriV、trfA、Ble^R和pSH-SceI目的片段連接，得到質粒pSHTB10；所述的質粒pSH-SceI的構建方法是通過PCR擴增I-SceIDNA序列，將其與限制性內切酶ClaI酶切的pSH47目的片段連接，得到質粒pSH-SceI；所述的質粒pSWB的構建方法是通過限制性內切酶BamHI酶切質粒pDGICZ和pSW-2，將其目的片段連接，得到質粒pSWB。

6.如權利要求2所述的iTAR載體的構建方法，其特征在于，包括引物設計、基因克隆和載體構建，具體為通過合成引物PCR擴增相應的兩個同源臂片段及I-SceI酶切位點，與經不破壞pSHTB10功能元件的限制性內切酶酶切回收的目的DNA片段連接，得到相應的iTAR載體。

7.如權利要求3所述的iTAR載體的構建方法，其特征在于，包括引物設計、基因克隆和載體構建，具體為通過合成引物PCR擴增HR1和HR2 DNA片段，與經限制性內切酶FspI酶切的pSHTB10片段連接，得到iTAR載體pSHTB10-HR12。

8.如權利要求4所述的iTAR載體的構建方法，其特征在于，包括引物設計、基因克隆和載體構建，具體為通過合成引物PCR擴增HR3和HR4 DNA片段，與經限制性內切酶FspI酶切的pSHTB10片段連接，得到iTAR載體pSHTB10-HR34。

9.如權利要求2～4所述的iTAR載體在捕捉大片段DNA中的應用，其特征在于，具體應用方法如下：

步驟1：針對目標線性大片段DNA的兩端設計合成相應DNA片段，用體外轉錄的方式獲得gRNA；

步驟2：利用Cas9核酸酶和gRNA可以特異性切割DNA的特性得到目標線性DNA；

步驟3：將iTAR載體轉化到釀酒酵母中，通過將目標線性DNA片段轉化至經半乳糖誘導的且含iTAR載體的釀酒酵母中，篩選陽性克隆，得到相應的捕捉載體；

步驟4：將捕捉載體轉移至相應的模式菌株中使其表達，實現外源大片段DNA的克隆和表達。