[發明專利]一種酶活提高的L-天冬氨酸β-脫羧酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201711354029.X
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN108070581B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 饒志明;汪芳;楊套偉;徐美娟;張顯
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種酶活提高的L?天冬氨酸β?脫羧酶突變體及其應用，屬于基因工程領域。本發明的突變體是在SEQIDN0.2所示的氨基酸的基礎上，將第484位亮氨酸突變成甲硫氨酸。因為表達包涵體問題將構建的重組載體L484M?pET28aN端起始密碼子后一段冗余序列刪除得到重組質粒L484M?pET28a?M。本發明得到的突變體在大腸桿菌中表達，經純化得到的酶做酶學性質研究，pH4.5、pH5.0、pH6.5下相對酶活分別提高了40％、36％、42％。L484M和未突變酶在相同酶活不同pH條件下進行全細胞轉化1h取樣測定產量，在最適pH5.5條件下，產量提高48.5％。本發明表明484位氨基酸殘基對酶的催化作用有較大影響，對該酶的催化機理的研究提供了一定的基礎，并提高了該酶的工業應用潛力。

技術領域

本發明涉及一種酶活提高的L-天冬氨酸β-脫羧酶突變體及其應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

L-丙氨酸是一種非必需氨基酸。隨著對L-丙氨酸不斷研究和開發，在食品、醫藥、化學合成等行業的應用不斷擴大。L-丙氨酸是存在于許多食品中的一種氨基酸，已經用作飲食的添加劑，如防腐劑，風味調味料，氨基酸低度酒和飲料等。在醫藥上的應用，通過水解蛋白制成氨基酸輸液，L-丙氨酸在治療如肝病引起的蛋白質合成紊亂、糖尿病、急慢性腎功能衰竭以及對維持危急病人的營養、搶救患者的生命方面起到了積極作用；L-丙氨酸可以有效地減輕酒精對肝臟的損害；L-丙氨酸還是血液保存劑的主要成分等。在化學合成中的應用，如合成抗癌物4-羥基水楊醛丙氨酸合鋅，合成VB5等。

L-丙氨酸制備經歷了由蛋白水解提取法、發酵法到酶法(固定化細胞法或游離整體細胞法)的過程。現在工業化生產的方法就是酶法轉化，即通過富有L-天冬氨酸-β-脫羧酶活力的微生物(如Pseudomonas dacunhae等)細胞催化L-天冬氨酸而得到的，而L-天冬氨酸則可通過固定化Escherichia Coli高效地催化富馬酸銨而制得。其中日本多采用固定化細胞法，而我國均采用游離整體細胞法。

固定化法是將P.dacunhae用卡拉膠固定化與固定化大腸桿菌分別裝柱串聯，從而達到從富馬酸銨到L-丙氨酸的連續化生產。M.Furui等人用密封的加壓反應器，使CO₂溶于混和液中，保證了平推流特性和防止細胞流失，很好的解決了天冬氨酸脫羧反應過程中的CO₂釋放從而破壞固定化細胞，導致細胞流失和流體出現返混現象問題，為了防止L-天冬氨酸-β-脫羧酶活力的固定化失活、pH調整失活和抑制丙氨酸消旋酶活力，在固定化前將整體細胞用醋酸、PLP溶液(pH 4.75)和戊二醛進行處理。

游離整體細胞法是將P.dacunhae發酵培養，以培養液作為酶源，直接添加固體L-天冬氨酸實現酶法轉化。Goto.Markoto將P.dacunhae細胞用EDTA等表面活性劑處理來提高酶的活力；而抑制消旋酶可以通過調整酶催化反應的pH值進行，一般pH控制在4.5～5.5之間。游離整體細胞法的關鍵技術是如何提高酶活力和酶的穩定性、防止消旋酶的產生。Goto.Markoto的方法較好的解決了這些問題。

綜上所述，目前L-天冬氨酸β-脫羧酶催化合成L-丙氨酸缺陷，酶反應pH范圍較窄，會導致pH調整失活，對過程控制要求較為嚴格等問題。本發明旨在對L-天冬氨酸β-脫羧酶進行突變，擴寬其pH作用范圍，降低酶催化操作難度，提高其工業應用價值和生產效率。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種酶活提高L-天冬氨酸β-脫羧酶突變體，所述突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體是在氨基酸如序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基礎上，將484位氨基酸由亮氨酸突變成甲硫氨酸。

本發明的第二個目的是提供編碼所述突變體的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。