[發明專利]一種提高D-氨基酸氧化酶可溶性異源表達的方法

有效

• 申請號: 201711352455.X
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN107881159B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 饒志明;鄭俊賢;楊套偉;周俊平;張顯;徐美娟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/40;C12P13/04;C12P35/02;C12Q1/26;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種提高D?氨基酸氧化酶可溶性異源表達的方法，屬于基因工程技術領域。本發明的突變體是在SEQ ID N0.2所示的氨基酸的基礎上，在甲硫氨酸后面添加三個額外的組氨酸和一個甘氨酸。本發明得到的突變體獲得的體積酶活比野生型提高3.4倍。同時突變體經5L發酵罐發酵最終獲得體積酶活為86.8U/mL，體積產率為4.52kU·L^?1·h^?1，為圓冬紅酵母在大腸桿菌中表達獲得的最高酶活，加強了該酶的工業應用潛力。

技術領域

本發明涉及一種提高D-氨基酸氧化酶可溶性異源表達的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

D-氨基酸氧化酶(DAAO,EC 1.4.3.3)具有高效立體選擇性催化D-氨基酸生成相應的α-酮酸的生物催化劑，該過程同時伴隨著還原態的黃素腺嘌呤二核苷酸被分子氧重新氧化生成副產物過氧化氫。D-氨基酸氧化酶前期主要作為關鍵酶被用于抗生素中間體7-氨基頭孢烷酸的合成，由于D-氨基酸氧化酶具有底物的光譜性，D-氨基酸氧化酶也被開發用于食品、藥品中D-氨基酸的檢測，及應用于手性純L-氨基酸和α-酮酸的生成。

目前，研究比較透徹且報道具有較好應用潛力的D-氨基酸氧化酶主要來源于圓紅冬孢酵母菌和三角酵母。大腸桿菌作為高效異源表達蛋白的首選宿主具有培養簡單、遺傳信息透徹和分子操作方便等優勢，但是D-氨基酸氧化酶在大腸桿菌中異源表達主要存在于包涵體中酶活很低，且活性的D-氨基酸氧化酶對大腸桿菌細胞壁D-丙氨酸又降解作用阻礙了其高效表達。針對異源表達外源基因時出現包涵體現象，目前主要的解決辦法有：密碼子偏好性優化、低溫誘導或者降低誘導劑濃度、目的蛋白N-端添加分子伴侶或者是融合血紅蛋白等大標簽可溶性蛋白等等。

發明內容

為了解決上述問題，本發明通過對來源于圓紅冬孢酵母菌D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列進行改造來提高其大腸桿菌中的可溶性表達，同時保證大腸桿菌的細胞生長，從而獲得最大效益和最大產量的D-氨基酸氧化酶。

本發明的第一個目的是提供一種高效異源表達的D-氨基酸氧化酶突變體，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述突變體的氨基酸序列是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基礎上，在第二位氨基酸組氨酸后面添加兩個額外的組氨酸和一個甘氨酸。

本發明的第二個目的是提供編碼所述突變體的核苷酸序列。

在本發明的一種實施方式中，編碼所述突變體的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。

在本發明的一種實施方式中，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基礎上，在其甲硫氨酸后面添加三個額外的組氨酸和一個甘氨酸密碼子而得到的。

本發明的第三個目的是提供含有編碼所述突變體的核苷酸序列的重組表達載體。

本發明的第四個目的是提供一種表達所述D-氨基酸氧化酶突變體的基因工程菌。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌是將SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列連接到表達載體得到重組質粒，然后將重組質粒轉化到宿主菌，即得到基因工程菌。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌為重組大腸桿菌基因工程菌。

在本發明的一種實施方式中，所述表達載體是pXMJ19。

在本發明的一種實施方式中，所述宿主菌為E.coli BL21。

本發明的第五個目的是提供所述基因工程菌的制備方法，所述方法是在SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的基礎上，在其第二位氨基酸組氨酸后面添加兩個額外的組氨酸和一個甘氨酸密碼子而得到的，得到重組基因，將重組基因連接到表達載體得到重組質粒，重組質粒轉化到大腸桿菌BL21宿主菌中即得到重組基因工程菌。