[發明專利]用于人EGFR基因突變檢測的試劑盒及臨床應用

在審

• 申請號: 201711350078.6
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN109929929A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 馬永;丁燕芬;丁娜
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種人EGFR基因突變檢測的引物、探針及試劑盒。發明篩選的特異性ARMS引物及探針，及優化的反應體系，能夠獲得檢測性能優異的用于人EGFR基因突變檢測的試劑盒，該試劑盒檢測快速，90分鐘即可完成檢測；靈敏度高，可以檢測10ng DNA樣品中含量低至1％的EGFR基因突變；特異性高，與野生型樣品無擴增；操作簡便，成本低廉，有利于規模化，市場化，能有效應用于臨床精準指導用藥。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，更具體地說，涉及一種人EGFR基因突變檢測的引物、探針及試劑盒。

背景技術

EGFR(表皮生長因子受體)是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，是原癌基因C-erbB-1的表達產物，基因定位于第7號染色體短臂，由28個外顯子組成，全長200kb。研究表明在許多實體腫瘤中存在EGFR的高表達或異常表達。EGFR與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關。EGFR的高表達可引起下游信號傳導的增強；受體下調機制的破壞；異常信號傳導通路的激活等。EGFR的過表達在惡性腫瘤的演進中起重要作用，膠質細胞、腎癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等組織中都有EGFR的過表達。突變型EGFR的作用可能包括：具有配體非依賴型受體的細胞持續活化；由于EGFR的某些結構域缺失而導致受體下調機制的破壞、異常信號傳導通路的激活、細胞凋亡的抑制等。截止2017年，FDA共通過了10種以EGFR為靶點的靶向藥物，包含厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼等6種小分子抑制劑以及西妥昔單抗、尼妥珠單抗、帕尼單抗等4種大分子靶向藥物。EGFR基因檢測有助于臨床指導用藥。

EGFR基因突變多位于外顯子18-21。最常見的突變包括外顯子19缺失突變和外顯子21點突變，這兩種突變約占所有突變的85-90％。外顯子19的堿基缺失主要是第746-752位密碼子的缺失，導致EGFR蛋白中氨基酸序列丟失，這一缺失改變了受體酪氨酸激酶ATP結合槽的角度，從而增強細胞對TKI制劑的敏感。外顯子21的點突變主要是位于第858位密碼子出現T-G轉換，引起蛋白中該位點的氨基酸由亮氨酸轉變為精氧酸，即L858R，此結構改變也使細胞對TKI制劑的敏感性增強。我國EGFR-TKI治療的Meta分析示具有EGFR敏感突變的患者有效率高達60.75％。同吋與化療相比EGFR-TKI具有更好的臨床療效，不良反應輕微，服用方便，患者的生活質得到極大改善。非小細胞肺癌中EGFR的突變主要集中于第18、19、20和21號外顯子，其中以19號外顯子和21號外顯子突變為主。其中l9外顯子上747-750為氨基酸的大約有20多種不同缺失，約占突變的45％；2l外顯子的突變40-45％；18外顯子約5％，20外顯子上的插入突變約占1％。

臨床EGFR檢測主要用于腫瘤靶向藥物使用前的匹配性檢測，外顯子18、19、21突變，顯示使用EGFR-TKI靶向藥物療效較好；而外顯子20突變提示耐藥性。患者服用一階段后再次進行突變檢測，外顯子20有繼發性突變，提示療效不佳。本項目開發試劑盒主要檢測針對EGFR基因第19、20和21號外顯子進行檢測。

現有的基因突變檢測方法主要有直接測序、限制性小片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、高分辨率溶解曲線分析(HighResolution Melting Curve Analysis，HRM)等。直接測序法靈敏度較低，檢測周期長，成本高昂，通量不高，而且是非閉管反應，難以避免交叉污染。RFLP法存在檢測周期長，操作繁瑣，成本高昂，易污染等不足。HRM法同樣存在操作復雜，難以避免污染等缺點。