[發(fā)明專(zhuān)利]一種深淵海參來(lái)源的超氧化物歧化酶Cu,Zn SOD的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711348429.X
• 申請(qǐng)日: 2017-12-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107955806B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李亞男;張海濱;孔雪;劉君;劉合露
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院深?？茖W(xué)與工程研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/02
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

本發(fā)明公開(kāi)了一種深淵海參來(lái)源的超氧化物歧化酶Cu,Zn SOD的制備方法及其應(yīng)用，該方法通過(guò)提取Paelopatides sp.的總RNA，經(jīng)RT?PCR反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了編碼超氧化物歧化酶的基因序列PaSOD，在pColdⅡ載體中構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌Chaperone Competent Cell pG?KJE8/BL21中進(jìn)行重組蛋白可溶性表達(dá)，通過(guò)該方法制備的重組蛋白克服了原料來(lái)源難以獲取、蛋白變復(fù)性回收過(guò)程復(fù)雜繁瑣等不足，純化后的蛋白純度高、活力好，溫度適應(yīng)范圍廣，能夠抵御高濃度的消化酶消化，為該蛋白廣泛應(yīng)用于生物、食品、醫(yī)藥、美容等領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種深淵海參來(lái)源的超氧化物歧化酶Cu,Zn SOD的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)簡(jiǎn)稱(chēng)SOD，是一種廣泛存在于自然界的生物酶，按所含金屬種類(lèi)不同可分為銅鋅SOD、錳SOD、鐵SOD以及鎳SOD等幾種。現(xiàn)在市場(chǎng)上出售的SOD大多都從血液中提取，屬銅鋅SOD(Cu,Zn-SOD)。Cu,Zn-SOD分子由兩個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基含有一個(gè)銅離子和一個(gè)鋅離子，分子量在32000Da左右。SOD是一種生物酶，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，國(guó)內(nèi)外對(duì)其毒性進(jìn)行了廣泛的研究。實(shí)驗(yàn)表明，它對(duì)人體無(wú)毒副作用，是一種純天然的生物活性物質(zhì)。

Cu,Zn-SOD是一種特殊的生物酶，因此具有許多特殊的功能，當(dāng)前地球生存環(huán)境日益惡化，誘發(fā)產(chǎn)生大量自由基，對(duì)人體健康產(chǎn)生影響。研究表明，通過(guò)適量補(bǔ)充攝入SOD，人體可能通過(guò)一些特殊的消化吸收機(jī)制，使得一定量SOD進(jìn)入人體發(fā)揮功能，從而有效保護(hù)人體細(xì)胞不受到過(guò)量氧自由基的破壞，延緩細(xì)胞的衰老過(guò)程，延長(zhǎng)壽命(Cicek E,Yildiz M,Delibas N,et al.The effects of 201Tl myocardial perfusion scintigraphystudies on oxidative damage in patients[J].West Indian Medical Journal,2009,58(1):50.)。此外，國(guó)內(nèi)外SOD的應(yīng)用還集中在作為藥用酶原料、化妝品的添加劑、功能食品的強(qiáng)化劑等幾個(gè)方面。目前SOD應(yīng)用技術(shù)的主要瓶頸仍然是傳統(tǒng)的動(dòng)植物提取出來(lái)的SOD存在穩(wěn)定性較差，活性難以保持等。因此，開(kāi)發(fā)高效優(yōu)質(zhì)SOD基因，利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)提取SOD勢(shì)在必行。深淵生物生存環(huán)境惡劣，由于受到采樣技術(shù)和樣品保存的限制，目前對(duì)其功能基因的開(kāi)發(fā)存在國(guó)內(nèi)外研究匱乏的現(xiàn)象。對(duì)其SOD的報(bào)道也相對(duì)較少，尤其是Cu，Zn-SOD。另外，目前通常使用的蛋白表達(dá)制備方法多以包涵體的方式進(jìn)行，表達(dá)的蛋白常常沒(méi)有活性，不可回收或者要進(jìn)行變復(fù)性回收。存在成功率低，操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，酶活損失大等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)目前SOD穩(wěn)定性較差，活性難以保持，優(yōu)質(zhì)SOD基因難以獲取、蛋白變復(fù)性回收過(guò)程復(fù)雜繁瑣等不足的問(wèn)題，提供了一種深淵海參來(lái)源的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD及其制備方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種深淵海參Paelopatides sp.來(lái)源的超氧化物歧化酶的編碼蛋白，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有相似或同等功能的氨基酸序列。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種編碼上述蛋白的基因。

進(jìn)一步地，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種含有上述基因的pColdⅡ載體。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種含有上述載體的Chaperone Competent Cell pG-KJE8/BL21表達(dá)宿主細(xì)胞。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種深淵海參來(lái)源的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD的制備方法，具體按照以下步驟實(shí)施：