[發(fā)明專利]海藻渣發(fā)酵法制備生產(chǎn)微藻用培養(yǎng)基的生產(chǎn)工藝

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• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN108048331A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳振祥
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省金燕海洋生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12R1/89
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.海藻渣發(fā)酵法制備生產(chǎn)微藻用培養(yǎng)基的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟：

產(chǎn)纖維素酶的菌株的篩選：

選取海藻渣腐爛部位，接種于海藻渣和蒸餾水配制成的勻漿培養(yǎng)液中，將富集后的發(fā)酵液采用10倍梯度法稀釋后，再涂布在初篩培養(yǎng)基平板上，待長出菌落后，用接種針挑出同一平板上不同形態(tài)的菌落，將菌落轉(zhuǎn)接到復(fù)篩培養(yǎng)基上進(jìn)行單菌落分離，最終得到多株純的單一菌落；將得到的單一菌落用剛果紅染液染色30min，再用1mol/L的NaCl溶液脫色15min，測量透明圈和菌株直徑的大小，計算透明圈和菌株直徑的比值，篩選出比值大于5的菌株；將種子液按5%的量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，收集上清液測定濾紙酶(FPA)、內(nèi)切葡聚糖酶(CMC)、外切葡聚糖酶(CBH)、β-葡聚糖苷酶的酶活力，將酶活力高的菌株在斜面上連續(xù)傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測每次傳代后的發(fā)酵情況，保存遺傳穩(wěn)定性較強的菌株；

產(chǎn)酶條件的優(yōu)化：

將纖維素酶活力最高的菌株接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期進(jìn)行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，探討不同的pH、溫度、氮源、底物濃度、搖床速度、培養(yǎng)時間對藻渣纖維素的分解及寡糖積累的影響，選擇以下的條件培養(yǎng)：

①培養(yǎng)基中初始pH值分別用1N H2SO4或1N NaOH調(diào)整為pH5.0-8.0之間，每隔1個pH值設(shè)置為一個測試點；

②測試溫度調(diào)節(jié)為25℃-40℃，每隔5℃為一設(shè)置溫度；

③酵母粉的濃度設(shè)置為0.5 g/L-3.5 g/L；

④海藻渣的濃度均分為8個梯度：依次為5.0 g/L、6.0 g/L、7.0 g/L、8.0 g/L、9.0 g/L、10.0 g/L、11 g/L和12.0 g/L來確定最佳底物濃度，能夠使海藻渣纖維素最大程度的降解；

⑤搖床速度（溶解氧含量）：100rpm，130rpm，150rpm，180rpm；

⑥培養(yǎng)時間為12-120h，在本發(fā)明的寡糖產(chǎn)量達(dá)到最高時結(jié)束發(fā)酵；

每6h取樣，分別測定發(fā)酵液上清的酶活性及糖產(chǎn)量，經(jīng)如上述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，確定產(chǎn)生寡糖的最優(yōu)發(fā)酵條件；

c、利用產(chǎn)纖維素酶的菌株處理海藻渣制備含DHA微藻的培養(yǎng)基：

將纖維素酶活力最高的菌株接入種子培養(yǎng)液中，28-29℃、180-185rpm搖床培養(yǎng)至對數(shù)期，取海藻加工后產(chǎn)生的海藻渣，按比例配置發(fā)酵培養(yǎng)基；

d、纖維素降解率的測定：

將上述培養(yǎng)基恒溫發(fā)酵，每發(fā)酵12h取樣一次，配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及DNS試劑，在550nm處用分光光度計測定反應(yīng)溶液的OD值，以葡萄糖濃度作為縱坐標(biāo)，A550值為橫坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸出標(biāo)準(zhǔn)方程，計算寡糖含量，發(fā)酵結(jié)束后，過濾剩余藻渣纖維素及珍珠巖，檢測纖維素降解率，糖化液可直接作為含DHA微藻的培養(yǎng)基的碳源添加使用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海藻渣發(fā)酵法制備生產(chǎn)微藻用培養(yǎng)基的生產(chǎn)工藝，其特征在于：所述步驟a中海藻渣和蒸餾水的質(zhì)量比為1:1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海藻渣發(fā)酵法制備生產(chǎn)微藻用培養(yǎng)基的生產(chǎn)工藝，其特征在于：所述步驟a中剛果紅染液的質(zhì)量濃度為0.1%。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海藻渣發(fā)酵法制備生產(chǎn)微藻用培養(yǎng)基的生產(chǎn)工藝，其特征在于：所述步驟c中培養(yǎng)基的配置比例為海藻渣35-65 g/L，蛋白胨2 g/L，MnSO4 0.5 g/L，酵母粉4 g/L，K2HPO4 0.5 g/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海藻渣發(fā)酵法制備生產(chǎn)微藻用培養(yǎng)基的生產(chǎn)工藝，其特征在于：所述步驟d中恒溫發(fā)酵的條件為裝料量35-65 g/L，控制pH值恒定為7.0±0.5，攪拌速度150rpm，菌株接種量5%，通氣量（V空氣/V氧氣）1:0.5-1.0，發(fā)酵溫度恒定為30±0.1℃，溶解氧含量為25-35%，培養(yǎng)時間24-120h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海藻渣發(fā)酵法制備生產(chǎn)微藻用培養(yǎng)基的生產(chǎn)工藝，其特征在于：所述步驟d中的分光光度計為紫外可見分光光度計。