[發明專利]一種提高DNA高保真聚合酶PCR擴增效率與擴增長度的方法

在審

• 申請號: 201711343604.6
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN109897893A
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 中禾生物種業集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明介紹了一種提高高保真DNA聚合酶PCR擴增效率的方法。該方法通過在PCR高保真酶反應體系中加入Triton X?100，羥丙甲基纖維素和氯化鎂緩沖液等方法來提高高保真DNA聚合酶的擴增效率。該方法提高了普通高保真DNA聚合酶的擴增長度，擴增速度，擴增效率，具有非常簡便快速，有利使用的優點。

技術領域

本方法涉及到一種高保真DNA聚合酶的擴增即使，通過改進高保真DNA聚合酶的反應緩沖液和加樣步驟，能夠實現高保真DNA聚合酶最大的DNA擴增效率

背景技術

PCR是現代分子生物學技術非常常用的技術，由此由該技術也衍生出來了許多的技術方法和改進應用技術運用。PCR是一種利用聚合酶擴增的基因DNA片段的方法，在不斷升溫和退火降溫的過程中，通過人工設計的靶向引物，可以在聚合酶的幫助下，結合靶標DNA而有靶向性的只擴增目的專有片段。利用該技術，可以大大的加速研究的靶向基因的濃度，方便下游的DNA片段的處理和操作。

在現代分子生物學基因擴增的過程中，我們經常會面對不得不擴增長片段的苦惱。這些長片段往往長于一十甚至二十kbp以上，而且這些序列的核酸往往富含高GC含量，序列的復雜度高。在提取DNA的過程中，如何模板不純，我們也往往需要面對復雜模板的過程。在這樣的模板中，甚至可能存在一些抑制DNA聚合酶功能的因素，導致擴增效率下降。

在目前，我們主要依靠經過改進的PCR聚合酶來進行DNA長片段的擴增，如果DNA片段過長，會極大的影響擴增的效率，擴增的過程容易中斷，酶容易從模板上脫落下來。而如果一個PCR酶已經固定了，如何針對這個固定的酶優化反應條件，進一步提高其擴增能力，增加擴增長度，包括跨越超長的GC復雜模板區域也是一個問題。另外，在DNA擴增的過程中，對DNA擴增序列的保真性有時候要求很高。某些DNA聚合酶具有強大的3-5’校正功能，可以用于一些保真性非常高的實驗需求。但同時擁有強大的校正功能的DNA聚合酶，由于在擴增的過程中需要不停的進行序列校正，卻往往擴增得很慢，導致擴增效率不高。這種DNA高保真酶也對各種反應條件的兼容性普遍不高，對各種復雜序列的處理也乏力，其擴增長度也大減。所以，針對這類聚合酶的反應狀況，如何提再高他們的擴增效率與擴增長度，也是值得我們進一步考慮的問題。

本實驗室摸索了一套針對高保真DNA聚合酶的擴增條件，經過優化的實驗條件和擴增條件，能夠比較有效的擴增長片段和復雜GC含量的模板，對一些比較復雜的DNA樣品，也有著較強的兼容能力。

發明內容

目的是為了解決利用高保真DNA聚合酶擴增的過程中，如何進一步增大高保真DNA聚合酶的活力，解決高保真DNA聚合酶擴增復雜模板和長片段所面臨的問題。

附圖說明

對比普通的PCR過程，我們擴增內參基因和長的高GC含量的靶基因片段NCBI參考序列號AF493800作為參照。內參基因的引物為：5’ccacctcttcgagcaggtgatt和5’ctacgatttgtttttggttttt。擴增程序為95度變性5min，循環階段為95度變性30秒，55度退火30秒，72度延伸30秒，共35個循環，最后延伸72度10分鐘，16度下停止。對于長片段高GC含量的靶標基因，我們擴增序列為AF493800，引物為5’AGAAAGCTCACTCCTCTTC和5’GCATTTTCTCTTGCCAAAGGCAG擴增條件為95度變性5分鐘，循環階段為95度變性45秒，60度退火45秒，72度延伸時間分別為120秒，擴增34個循環，最后延伸都是72度10分鐘，16度停止反應。在1.2％的瓊脂糖凝膠下EB染色檢測結果如圖。

我們發現經過改良的PCR緩沖液的配方和反應條件，能夠極大的增加PCR的擴增效率，即使在高GC含量的模板，長PCR擴增產物的要求下，也能比原來方法達到更好的效果。圖1高保真酶PCR內參基因電泳，圖2高保真酶長靶標基因電泳。

具體實施方式

經過摸索的高保真DNA聚合酶的擴增條件：在擴增的體系中，以20ul的擴增體系為例，加入0.5ul的Triton X-100入PCR反應液中，另外加入微量的0.5ul的羥丙甲基纖維素氯化鎂緩沖液。羥丙甲基纖維素氯化鎂緩沖液的配方為1L的去離子水中，含有羥丙甲基纖維素15克，氯化鎂10克。PCR實驗前，先在冰上加入羥丙甲基纖維素氯化鎂緩沖液和PCR的緩沖液預先混合，然后再與PCR的反應酶預先混合。最后PCR的時候，將緩沖液和DNA模板，引物等進行混合。其它的擴增條件，都根據模板來設置。其引物設計和高保真酶的反應條件的和正常的高保真DNA聚合酶的擴增條件一致。