[發明專利]肝片吸蟲多表位融合診斷抗原及其應用和制備方法

有效

• 申請號: 201711340304.2
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN108101974B
• 公開（公告）日: 2020-05-05
• 發明（設計）人: 孟慶玲;喬軍;王熙鳳;喬夢凡;張凱;張國武;黃運福;孟丹;陳瑛;李重陽;貢莎莎;劉昱成
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/70;G01N33/569;G01N33/68
• 代理公司: 烏魯木齊恒智專利商標代理事務所(普通合伙) 65102
• 代理人: 李伯勤

本發明公開了一種肝片吸蟲多表位融合診斷抗原分子Fh?meAg2的制備方法及其應用，屬生物技術領域。本發明通過對Fh重要基因SAP2、Cathepsin L1D和Cathepsin B4和進行克隆，利用生物信息學軟件對Fh重要基因編碼蛋白的氨基酸序列進行分析，篩選優勢抗原表位，并將采用柔性氨基酸將篩選得到的優勢抗原表位按照一定的排列組合進行串聯，構建并合成多表位融合抗原(Fh?meAg)基因。將Fh?meAg基因克隆入表達載體中，在大腸桿菌中進行表達，制備重組蛋白Fh?meAg，通過血清學試驗篩選獲得了強反應原性的重組蛋白Fh?meAg2。即210(3)。與現的技術相比，本發明的肝片吸蟲重組多表位融合抗原Fh?meAg2的具有高特異性和敏感性，是一種有應用價值的Fh感染診斷抗原分子。

技術領域

本發明涉及一種肝片吸蟲多表位融合診斷抗原分子Fh-meAg2的制備方法及其應用，屬生物技術領域。

背景技術

肝片吸蟲病(Fascioliasis)是由肝片吸蟲(F.hepatica，Fh)所引起的一種草食動物常發寄生蟲疾病。成年動物感染多呈慢性發病，難以早期診治，而幼年動物發病臨床癥狀明顯，嚴重可致死亡。

該寄生蟲能對肝臟和腸道造成機械性損傷，引起器官組織創傷、出血，寄生于膽管中的蟲卵和幼蟲堵塞膽汁通道，引發肝炎、膽管炎、腹膜炎；肝片吸蟲生長以紅細胞為養料，可致紅細胞減少和血管滲透性增強，導致機體貧血，嚴重影響了反芻動物養殖業的發展。同時，Fh還可以引起人感染，是一種對牧民危害較大的人獸共患寄生蟲病。

肝片吸蟲(F.hepatica，Fh)又稱肝蛭或柳葉蟲，屬扁形動物門(Platyhelminthes)、吸蟲綱腹殖目(Digenea)、片形科(Fasciolidae)片形屬(Fasciola)，可導致草食動物發生慢性高危性寄生蟲病。肝片吸蟲的終末宿主是牛、羊、駱駝等動物，中間宿主是椎實螺。成蟲在膽管內聚集，排出大量蟲卵，蟲卵隨膽汁進入消化道，隨糞便排出體外。蟲卵在適當的溫度、水分及光線的環境中形成毛蚴。毛蚴鉆入椎實螺，在螺體內經過胞蚴、雷蚴，最后形成尾蚴，排出螺體，在水面植物葉子上結囊形成囊蚴。囊蚴在草食動物吃草時被吞食，進入動物十二指腸內脫囊成為幼蟲。幼蟲穿過腸壁進入腹腔，再經肝包膜進入肝臟移行到膽管，在膽管內發育成成蟲。幼蟲在機體內穿過十二指腸，給腸壁造成機械性損傷；進入腹腔后，穿透肝包膜，在肝臟中穿行，造成肝臟組織創傷。蟲體代謝產物的毒性作用、機械性損傷，可導致動物發病甚至死亡。

肝片吸蟲病的診斷對于及時治療病畜、減少死亡和經濟損失具有重要的意義。

近年來，國內外學者對肝片吸蟲病的診斷進行了研究，特別是一些新的免疫學、分子生物學檢測技術的應用，使該病的診斷方面有了較大的進展。

目前，肝片吸蟲病的診斷主要包括糞便中蟲卵檢查、抗原檢測和特異性抗體檢測。

糞便中蟲卵檢查是Fh感染檢測的常用方法，但是蟲體一般都在感染后2-3個月才能成熟排卵，因此，糞便中蟲卵檢測不適合早期感染的診斷。

糞抗原檢測是基于MM3單克隆抗體建立的檢測糞便中Fh抗原的ELISA診斷方法，該方法可檢測到Fh感染后5周糞便中的抗原，相對于蟲卵檢測而言，能夠更早的檢測Fh。

Fh抗體檢測方法主要包括變態反應、間接血凝試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、斑點酶聯免疫吸附試驗(Dot-ELISA)、親和素-生物素酶聯免疫吸附試驗(BA-ELISA)等。

Mezo等(2007)和Muino等(2011)制備了抗Fh L1和L2組織蛋白酶的單克隆抗體MM3，利用組織蛋白酶L建立了檢測肝片吸蟲感染的捕獲ELISA，用于動物奶或血清樣品的檢測。Gottstein等建立了基于鞘脂激活蛋白樣蛋白-2的檢測肝片吸蟲感染的ELISA方法。