[發明專利]VP2基因和NP基因重組腺病毒及其應用

有效

• 申請號: 201711338986.3
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN108060141B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 高柯柯;李亞杰;郁宏偉;付旭彬;劉海霞;鄭文卿;唐榮宏;李蓬飛
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/85;C12N15/34;A61K35/761;A61P31/14;A61P31/16;C12R1/93
• 代理公司: 天津合志慧知識產權代理事務所(普通合伙) 12219
• 代理人: 張勇

1.一種VP2基因和NP基因重組腺病毒，其特征在于是由以下方法制備的：

1)從IBDV中擴增出VP2基因；從AIV的SD株中擴增出NP基因；

2)將獲得的目的基因亞克隆到腺病毒穿梭載體質粒pDC315-MCS-EGFP上，獲得重組穿梭載體pDC315-VP2-NP-EGFP；

3)將重組穿梭載體pDC315-VP2-NP-EGFP與腺病毒大骨架質粒pBHGlox E1,3Cre共轉染HEK293細胞，重組并包裝獲得重組腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP。

2.根據權利要求1所述的一種VP2基因和NP基因重組腺病毒，其特征在于步驟1)中VP2基因的擴增包括以下操作：以序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的DNA片段分別作為正向引物和反向引物，以IBDV的總RNA為模板，RT-PCR擴增獲得VP2基因。

3.根據權利要求1所述的一種VP2基因和NP基因重組腺病毒，其特征在于步驟1)中NP基因的擴增包括以下操作：以序列為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的DNA片段分別作為正向引物和反向引物，以AIV的RNA為模板，RT-PCR擴增獲得NP基因。

4.根據權利要求2或3所述的一種VP2基因和NP基因重組腺病毒，其特征在于所述RT-PCR的反應體系如下：One step PrimeScript Enzyme Mix 2μL，2×step buffer 12.5μL，正向引物1μL，反向引物μL，RNA polymerase 1.5μL，用RNase-free ddH₂O補齊至25μL。

5.根據權利要求4所述的一種VP2基因和NP基因重組腺病毒，其特征在于所述RT-PCR的反應條件如下：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，如此32個循環；72℃延伸10min。

6.根據權利要求1所述的一種VP2基因和NP基因重組腺病毒，其特征在于步驟2)中是先是將目的基因經T-A克隆至pMD19-T載體上；經酶切及測序鑒定后與穿梭載體pDC315-MCS-EGFP連接。

7.權利要求1～3任一項所述重組腺病毒用于制備預防禽傳染性法氏囊病和禽流感的生物制品中的應用。