[發明專利]manY/levF基因片段在生產丁醇中的應用

有效

• 申請號: 201711338709.2
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN107988242B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 吳又多;李穎;陳麗杰
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12;C12N15/74;C12P7/16;C12R1/145
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 劉慧娟;李馨

1.manY/levF基因片段在生產丁醇中的應用，所述manY/levF基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述manY/levF基因片段編碼如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述manY/levF基因片段在梭菌內過表達；所述梭菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) 。

2.根據權利要求1所述應用，其特征在于，所述應用為構建過表達manY/levF基因片段相關的生物材料；所述生物材料為下述一種：

(1)含有權利要求1所述的manY/levF基因片段的表達盒；

(2)含有權利要求1所述的manY/levF基因片段的重組載體或含有(1)所述表達盒的重組載體。

3.根據權利要求2所述應用，其特征在于，所述的(1)～(2)中任一項的生物材料中，還包含核苷酸序列為SEQ ID NO.3的硫解酶啟動子。

4.根據權利要求1所述應用，其特征在于，包括以下步驟：

(1)過表達重組質粒的構建：將核苷酸序列為SEQ ID NO.3的硫解酶啟動子thl序列經Pst I和Sal I酶切后與pIMP1質粒連接，得到載體質粒pIMP1-thl，以丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC 824基因組作為模板，利用PCR擴增核苷酸序列為SEQ ID NO.1的manY/levF基因片段，將其與載體質粒pIMP1-thl進行連接從而構建pIMP1-thl-manY/levF質粒；

(2)過表達重組質粒的擴增：將pIMP1-thl-manY/levF熱激轉化轉入E .coli DH5α進行擴增，提取質粒pIMP1-thl-manY/levF及測序驗證核苷酸序列位點有無突變或缺失；

(3)過表達重組質粒的甲基化：將核苷酸測序正確的重組質粒熱激轉化轉入E.coliDH10B(pAN1)中進行甲基化，得到甲基化質粒pIMP1-thl-manY/levF；

(4)通過電轉化法，將步驟(3)所得甲基化質粒pIMP1-thl-manY/levF轉化至丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC 824中，通過涂布于含有50μg/mL紅霉素抗性的TGY瓊脂培養基上，培養、篩選獲得含有甲基化質粒pIMP1-thl-manY/levF的過表達丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC 824(pIMP1-thl-manY/levF)。

5.根據權利要求4所述應用，其特征在于，所述電轉化法中使用的電轉緩沖液為ETM溶液和ET溶液；其中ETM溶液的配方為：270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM NaH₂PO₄及10mMMgCl₂；ET溶液的配方為：270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄及4.4mM NaH₂PO₄。

6.根據權利要求4所述應用，其特征在于，所述過表達丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumATCC 824(pIMP1-thl-manY/levF)能提高丁醇發酵過程中葡萄糖、果糖和菊芋水解液的利用率，以及提高丁醇的產量。