[發(fā)明專利]檢測IRF3中的S173磷酸化位點的抗體

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711336492.1
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN107973852A
• 公開（公告）日: 2018-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周芳芳;張龍;王林;王帥;代通;謝楓
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/44;C07K16/06
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)32257
• 代理人: 馮瑞,楊慧林

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測IRF3中的S173磷酸化位點的抗體。

背景技術(shù)

先天性免疫是宿主抵御病原體入侵的第一道防線，包括病毒。模式識別受體(PRRs)識別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)后，通過激活NF-kB、炎性體、I型干擾素(IFN-I)來激活先天性免疫。其中干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)是IFN-I信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，能夠組成性表達(dá)并且定位在靜息細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)PRRs如RIG-I、MDA5、TLR3和TLR4等，識別dsRNA，5’三磷酸RNA，CpG DNA等病原相關(guān)分子模式(PAMPs)之后，啟動一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，將信號傳遞至激酶TBK1和IKKε，TBK1和IKKε進(jìn)一步磷酸化IRF3C端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域中的S396、S398、S402、T404和S405位點，導(dǎo)致IRF3二聚化并進(jìn)入細(xì)胞核，最終誘導(dǎo)I型干擾素(IFN-I)的表達(dá)，在抗病毒天然免疫中發(fā)揮重要作用。然而，IFN-I的表達(dá)需要受到精準(zhǔn)的調(diào)控，其過度產(chǎn)生會引起一些疾病的發(fā)生，如炎癥性皮膚病、敗血性休克綜合征或者是自身免疫疾病等。

IRF3的磷酸化修飾在誘導(dǎo)IFN-I產(chǎn)生過程中起到重要作用，而探究IRF3磷酸化位點對于研究整個抗病毒先天免疫通路尤為重要。迄今，還沒有關(guān)于負(fù)調(diào)控抗病毒先天免疫的IRF3磷酸化位點的報道，也沒有用于檢測相關(guān)磷酸化位點的抗體報道。因此，找到一種檢測負(fù)調(diào)控天然免疫轉(zhuǎn)錄因子IRF3磷酸化位點的抗體具有重要的研究意義。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種檢測IRF3中的S173磷酸化位點的抗體，本發(fā)明一方面公開了磷酸化IRF3中的S173位的激酶，且提供了一種檢測該磷酸化位點的抗體，實現(xiàn)對負(fù)調(diào)控抗病毒先天免疫的IRF3磷酸化位點的快速檢測。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

在一方面，本發(fā)明公開了MEKK2激酶磷酸化IRF3中的S173位的應(yīng)用。

MEKK2是細(xì)胞內(nèi)的一類特異的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠使底物的絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生磷酸化，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)其能夠磷酸化IRF3中的S173位。

通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灱夹g(shù)(reporter assay)，鑒定出MEKK2為抗病毒先天免疫負(fù)調(diào)控蛋白，能夠顯著抑制IFN-β啟動子的激活。在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)MEKK2和IRF3過表達(dá)質(zhì)粒，通過免疫印跡技術(shù)檢測到MEKK2能夠磷酸化IRF3，并進(jìn)一步鑒定出MEKK2磷酸化IRF3的位點為S173。

在另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測IRF3中的S173磷酸化位點的抗體，抗體的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

進(jìn)一步地，使用MEKK2蛋白磷酸化IRF3的S173位。

進(jìn)一步地，抗體為多克隆抗體。

進(jìn)一步地，抗體的制備方法包括以下步驟：

(1)合成SEQ ID No.1所示的抗體的肽段并與KLH偶聯(lián)，得到抗原；

(2)將抗原與不完全弗氏佐劑(IFA)混合后每隔1周或2周注入動物體內(nèi)，進(jìn)行免疫，免疫六次后取動物全血，得到抗體。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，肽段的純度為85％以上。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，抗原與不完全弗氏佐劑的體積比為1:1。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，抗原的體積為500μL，質(zhì)量為250μg。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，動物選用兔子。

進(jìn)一步地，在步驟(3)中，在動物生長至第2周，進(jìn)行陰性血采集及第一次免疫，然后再第4周進(jìn)行第二次免疫、第6周進(jìn)行第三次免疫、第7周進(jìn)行第四次免疫、第8周進(jìn)行第五次免疫、第9周進(jìn)行第六次免疫，最后于第10周取動物全血。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：

IRF3的磷酸化修飾在誘導(dǎo)IFN-I產(chǎn)生過程中起到重要作用，而迄今發(fā)現(xiàn)的IRF3的磷酸化位點還停留在S396、S398、S402、T404和S405上，這些位點被磷酸化后能夠激活I(lǐng)RF3，起到增強抗病毒先天免疫的作用。發(fā)明人經(jīng)實驗證實，除了上述磷酸化位點外，IRF3中的S173位點也可被磷酸化，并能顯著抑制IRF3的活性，在調(diào)控IRF3介導(dǎo)抗病毒天然免疫過程中發(fā)揮重要作用，對于全面了解IRF3及信號通路具有重要意義。