[發明專利]一種基于活性炭和檸檬酸的煙草外植體防褐化方法

在審

• 申請號: 201711331435.4
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN108142289A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 曾婉俐;鄧樂樂;向海英;宋春滿;張濤;許力;張建鐸;蔣佳芮;蘇楊;李雪梅;陳章玉
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生;亢能

本發明涉及一種基于活性炭和檸檬酸的煙草外植體防褐化方法，包括如下步驟：步驟（1），種子的消毒；步驟（2），種子培養；步驟（3），煙草外植體預培養；步驟（4），煙草外植體組織培養；步驟（5），外植體防褐化培養；本發明將多種防褐化手段有效結合，彼此作用，不僅防褐化效果更佳，還使得生根天數大幅度縮短，外植體褐化率為9.9?15.9%，外植體7?10天生根，培養40?46天，根長＞1cm，根數≥2條，效果良好。

技術領域

本發明涉及一種煙草外植體防褐化方法，具體是一種基于活性炭和檸檬酸的煙草外植體防褐化方法，屬于植物組織培養領域。

背景技術

煙草是一種經濟價值較高的作物，在我國占有巨大的經濟市場。煙草除主要用于吸食、蛋白食用和藥用外，還具有廣泛的用途。隨著植物科學的發展，煙草作為基礎研究和應用中的模式作物在植物遺傳、發育、生理生化和此生代謝研究等方面發揮了重要的作用。但是煙草外植體在組織培養過程中的褐化問題是多發的常見的，幾乎不可避免，所以防止褐化是在煙草組織培養中要極力解決的問題。

產生褐化現象的外植體仍能生長并生根，但增殖速度和生根率受到明顯影響，情況嚴重還會導致外植體基部逐漸褐化并危及其生存。由于褐化現象只出現在少數組培苗中，而且與外植體材料的生理狀態有一定的關系，因此在外植體選材時需盡量選取幼嫩的生長旺盛的外植體，繼代過程中需要拋棄老枝部分，只將新生部分繼代，這樣可以減少部分褐化現象，但是這種操作所培養出的組培苗數量較少，不適宜大規模的生產。

克服煙草外植體褐化的方法主要有：接種前用抗氧化劑短時間浸泡外植體；培養基添加抗褐化劑（抗氧化劑、抗氧化酶活性促進劑和酚類物質吸附劑）；外植體熱激處理（45-50℃抑殺多酚氧化酶、苯并氨酸酶），培養物多次轉移到新鮮培養基。然而，這些方法雖然能起到一定的防褐化作用，但是效果不顯著。

針對煙草外植體，需要探索一種效果更好的防褐化方法。

發明內容

為了解決上述為問題，本發明的目的在于提供一種基于活性炭和檸檬酸的煙草外植體防褐化方法，可有效緩解煙草組培過程中出現的褐化問題。

本發明采用解決技術問題方案如下：

一種基于活性炭和檸檬酸的煙草外植體防褐化方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟（1），種子的消毒；

步驟（2），種子培養：將步驟（1）得到的種子接種到MS培養基中培養，種子發芽長成外植體幼苗，然后用浸泡過生土豆的水涂覆外植體幼苗表面；種子的培養條件為：在培養溫度為25±1℃，光照強度30-50μmol/(m²·s)，光照時間為16h/d的條件下培養60d；

步驟（3），煙草外植體預培養：將步驟（2）中得到的外植體幼苗轉移并接種于添加有10-15g/L核桃粒且包括有MS基本培養基、4g/L瓊脂、30g/L蔗糖的MS預培養固體培養基中培養，控制溫度為24℃，光照強度為1500lux，光照時間為10小時/天，培養時間為3天，最后將得到預培養后的外植體，反復接種于MS培養基4-5次，使組織中的酚類物質部分滲入培養基；

步驟（4），煙草外植體組織培養：將步驟（3）中得到的外植體置于MS分化培養基中培養，控制白天溫度為28℃，夜間溫度為25℃，光照強度為30-50μmol/(m²·s)，光照時間為16小時/天，培養時間為7天，得到外植體愈傷組織；

步驟（5），外植體防褐化培養：將步驟（4）中得到的外植體置于MS防褐化培養基中，控制白天溫度為28℃，夜間溫度為25℃，光照強度為30-50μmol/(m²·s)，光照時間為16小時/天，培養時間為40天；MS防褐化培養基為MS基本培養基中添加0.3-1.0g/L活性炭、4-8mg/L檸檬酸、30g/L蔗糖和4g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.7。