[發(fā)明專利]一種7β-羥基類固醇脫氫酶、編碼基因、載體、工程菌及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711327005.5
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN109913428B
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發(fā)明（設計）人: 阮禮濤;鐘胡軍;濮晶晶;王獻周;陳茜;顧虹
• 申請（專利權）人: 上海奧博生物醫(yī)藥股份有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12P33/06
• 代理公司: 北京柏杉松知識產權代理事務所(普通合伙) 11413
• 代理人: 王春偉;劉繼富

本發(fā)明公開了一種來源于馬賽梭菌(Clostridium?Marseille)的7β?羥基類固醇脫氫酶、編碼基因、載體，以及其在生物催化制備熊去氧膽酸中間體3,12?二酮?7β?膽烷酸中的應用，所述7β?羥基類固醇脫氫酶的氨基酸序列如SED?ID?NO:1所示；本發(fā)明提供了一種立體選擇性制備3,12?二酮?7β?膽烷酸的新7β?羥基類固醇脫氫酶；通過該7β?羥基類固醇脫氫酶可制備熊去氧膽酸中間體3,12?二酮?7β?膽烷酸；本發(fā)明中所述3,12?二酮?7β?膽烷酸制備方法具有光學純度高、條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點，具有較高的工業(yè)化應用潛力。

技術領域

本發(fā)明涉及一種7β-羥基類固醇脫氫酶及應用，特別涉及一種重組7β-羥基類固醇脫氫酶、編碼基因、含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，以及該酶或含有該酶的重組細胞為催化劑在制備熊去氧膽酸中間體3,12-二酮-7β-膽烷酸中的應用。

背景技術

熊去氧膽酸(UDCA)是名貴中藥熊膽粉所含的主要有效成分，是一種來自熊膽的次級膽汁酸，由初級膽汁酸經細菌代謝生成，在臨床上主要用于治療膽結石疾病以及各種急慢性肝病，具有良好的治療效果。中藥熊膽粉主要從人工養(yǎng)殖的熊中以“活熊引流取膽”的方式提取，這有違野生動物保護法，而且UDCA收率低，無法滿足市場需求，因而人工合成UDCA具有重要意義。下表提供了合成步驟中重要化合物的結構式、化學名稱和縮寫。

經典的化學法制備UDCA工藝以膽酸(CA)為原料，共需要7步反應制得UDCA。由于化學氧化是非選擇性的，CA上的羧基和3α、7α-羥基必須通過反復保護和脫保護，而且7-酮-石膽酸(7-keto-LCA)的催化加氫步驟選擇性低，工藝路線冗長，導致收率較低。此外，中間產物7-keto-LCA的還原用到金屬鈉或者Pd/C催化氫化，選擇性低，工業(yè)化放大生產不容易控制且不安全。

基于酶法制備UDCA的工藝主要有3條，如下所示：

Sun?B等(Sun?B,Kantzow?C,Bresch?S.Biotechnology?and?bioengineering,2013,110:68-77)描述了一種化學酶法制備UCDA的工藝(路線a)。首先利用化學法氧化CA制備DHCA，之后通過睪丸酮叢毛單胞菌(Comanomonas?testosteroni)的3α-HSDH和產氣柯林斯菌(Collinsella?aerofaciens)的7β-HSDH將DHCA還原成12-keto-UDCA，最后通過wolff-kishner還原反應獲得最終產物。在1L反應體系中利用上述兩酶催化0.1mol/L?DHCA制備12-keto-UDCA，最終反應收率達到99.5％。Monti?D等(Monti?D,Ferrandi?EE,ZanellatoI,Hua?L,Polentini?F,Carrea?G,Riva?S.Advanced?SynthesisCatalysis,2009,351:1303-1311)描述了另一條由CA出發(fā)制備UDCA的化學酶法工藝(路線b)。首先利用脆弱擬桿菌(Bacteroides?fragilis)的7α-HSDH和商品化12α-HSDH(Genzyme?Biochemicals?Ltd.)氧化CA制備7,12-二酮-3α-膽烷酸(7,12-dione-3α-CA)，之后通過Clostridium?absonum的7β-HSDH將7,12-dione-3α-CA還原成12-酮-熊去氧膽酸(12-keto-UDCA)，最后通過wolff-kishner還原反應獲得最終產物。此路線中涉及到3個可逆反應的控制，難度較大，文獻報道以CA為出發(fā)底物經由路線b制備12-keto-UDCA反應收率最高僅為73％。