[發(fā)明專利]磷脂酶C及其編碼基因

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711317381.6
• 申請日: 2017-12-12
• 公開（公告）號: CN109321546B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳偉;戴小軍;曹海生;牛其文
• 申請（專利權(quán)）人: 豐益（上海）生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/81;C11B3/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;黃希貴

本發(fā)明涉及磷脂酶C及其編碼基因。還涉及包含所述基因的載體以及宿主細(xì)胞。此外，還涉及所述生產(chǎn)所述磷脂酶C的方法以及所述磷脂酶C的用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新的磷脂酶C及其編碼基因。還涉及包含所述基因的載體以及宿主細(xì)胞。此外，還涉及所述生產(chǎn)所述磷脂酶C的方法以及所述磷脂酶C的用途。

背景技術(shù)

在制造植物類食用油時(shí)，初步經(jīng)過壓榨和浸出等方法從油料種子種提取而得的毛油，一般含有蛋白質(zhì)、甾醇、磷脂、色素、痕量金屬、游離脂肪酸等雜質(zhì)，影響食用油品質(zhì)，通常無法食用。所以，需要進(jìn)行油脂精煉。脫膠是植物油精煉過程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。近年來，酶法脫膠技術(shù)由于其反應(yīng)條件溫和、精煉得率高、環(huán)保及適用范圍廣等特點(diǎn)，得到了市場的廣泛關(guān)注。

磷脂酶是一類廣泛存在于動物、植物和微生物中，能夠特異性水解甘油磷脂的酶。根據(jù)磷脂酶與磷脂作用位點(diǎn)的不同，可將磷脂酶分為磷脂酶A1（PLA1），磷脂酶A2（PLA2），磷脂酶B（PLB），磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D（PLD）。目前，在植物油脫膠過程中，主要使用的是PLA1、PLA2、PLB和PLC。PLA1和PLA2能特異性水解磷脂的Sn-1 或Sn-2 位酯鍵，生成相應(yīng)的溶血磷脂；PLB能將Sn-1 和Sn-2 位的酯鍵都水解，生成相應(yīng)的甘油酰磷脂。溶血磷脂和甘油酰磷脂都具有很強(qiáng)的親水性，通過水合作用可以方便地除去。PLC能特異性水解磷脂Sn-3位上甘油磷酸酯鍵，生成相應(yīng)的甘二酯（DAG）和磷酯酸，而DAG作為中性油在后續(xù)的精煉過程中不會被去除，因而能有效提高油脂精煉后的得率。

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的磷脂酰膽堿-磷脂酶C (BC-PC-PLC)，是研究較早的一種磷脂酶C。BC-PC-PLC全長為283個(gè)氨基酸，其中包含24個(gè)氨基酸的信號肽和14個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽，成熟肽為245個(gè)氨基酸(Johansen, T., Holm,T., Guddal, P.H.,Sletten, K., Haugli, F.B., Little, C.(1988). Cloning and sequencing of thegene encoding the phosphatidylcholine-preferring phospholipase C of Bacilluscereus. Gene 65(2):293-304)。BC-PC-PLC的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被報(bào)道，其由多個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域組成，催化位點(diǎn)為55位天冬氨酸，并且含有至少三個(gè)Zn²⁺ 結(jié)合位點(diǎn)(Hough., E.,Hansen, L.K., Birknes, B., Jynge, K., Hansen, S., Hordvik, A., Little, C.,Dodson, E., Derewenda, Z. (1989) High-resolution (1.5 A) crystal structureof phospholipase C from Bacillus cereus. Nature. 338:357-60)。

在之前的研究中，專利CN104630174A中通過將BC-PC-PLC的三個(gè)糖基化位點(diǎn)即63位，131位和134位天冬酰胺分別突變?yōu)樘於彼幔z氨酸和天冬氨酸，從而使突變序列表現(xiàn)出的酶活相比于原始序列提高16倍；專利CN2016/110030中在糖基化位點(diǎn)突變序列的基礎(chǔ)上再將第56位酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸，從而提供一種在低硫酸鋅條件下表現(xiàn)出高磷脂酶酶活的變體，相較糖基化位點(diǎn)突變序列，在10μM硫酸鋅的條件下，酶活提高了7倍。為了進(jìn)一步提高該磷脂酶C的脫膠效率，本申請的發(fā)明人繼續(xù)對該磷脂酶C進(jìn)行突變，希望能夠得到酶活進(jìn)一步提高的突變體，從而能夠得到更高效的磷脂酶C，提高脫膠效率，增加脫膠過程中甘二酯(DAG)的得率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明在上述現(xiàn)有技術(shù)的所有突變的基礎(chǔ)上再將BC-PC-PLC第10位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼幔浔让富畋韧蛔兦暗男蛄刑岣吡?3%，且蛋白表達(dá)量和單位酶活的脫膠活性沒有變化，從而進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。