[發明專利]一種固定化漆酶及其制備方法

在審

• 申請號: 201711316937.X
• 申請日: 2017-12-12
• 公開（公告）號: CN108004230A
• 公開（公告）日: 2018-05-08
• 發明（設計）人: 張金帆;杜春艷;文曉鳳;譚詩楊;楊毓鑫;陳宏;余關龍;范慶元;錢湛
• 申請（專利權）人: 長沙理工大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N9/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種固定化漆酶及其制備方法，該固定化漆酶是以高嶺土為載體，漆酶通過物理吸附作用固定于高嶺土上。其制備方法為將高嶺土與漆酶溶液混合進行振蕩吸附，離心，得到固定化漆酶。經優化得到的最佳固定化條件：固定化時間為15min、pH為5.0、漆酶初始濃度為0.8mg/mL。本發明的固定化漆酶具有熱穩定性好、酶吸附量大、酶活力強、環境友好、對孔雀石綠/Cd2+去除效果好等優點，其制備方法具有操作簡便、易于控制、制備成本低、適合大規模制備等優點。

技術領域

本發明涉及漆酶的固定化領域，具體涉及一種固定化漆酶及其制備方法。

背景技術

漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）是一種苯二酚-氧化還原酶，屬于藍多銅氧化酶（Blue multi-copper oxidases，BMCOs）家族。漆酶分布比較廣泛，在真菌、昆蟲、細菌、藻類及其高等植物中均有發現，是一種催化底物范圍廣，催化效率高的綠色環保生物催化劑。目前，漆酶在環境污染物降解、木質素纖維改性、生物傳感器制造業、紡織業等應用價值顯著。但由于漆酶穩定性差、易失活、在使用過程中容易因為環境的變化而變形失活，且不易從反映體系中分離，產物的分離純化比較復雜，隨著反應時間的延長，反應速率也會逐漸下降，因此，漆酶的工業化應用在一定程度上受到了限制。固定化酶技術是克服了自由酶的上述不足，實現漆酶的連續使用和改善其穩定性的有效手段。固定化酶是指利用物理或化學的手段將酶固定在載體上或束縛在特定區域內，仍能保持原有催化特性，并可回收及循環使用的一類技術。

漆酶的固定化方法包括包埋法和化學法等，其中包埋法容易發生化學聚合反應，導致酶活力損失，并且該方法要求底物和產物是可以通過高分子凝膠的網格擴散的小分子，限制了大分子的酶和底物的應用等。而化學法固定化方法的缺點是載體需要活化劑提前處理；固定化操作比較復雜；反應條件比較強烈；化學修飾時易造成酶失活；蛋白質通過氨基酸側鏈功能基團參加共價連接往往會引起酶分子的結構變化從而導致活力降低，需要嚴格控制條件才能獲得活力較高的固定化酶。固定化酶中常用的固定化載體包括活性炭、海藻酸鈉、介孔材料以及微濾膜等，但現有的固定化材料存在固定化效率低、加工工藝復雜、成本高等缺點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：針對現有技術的不足，提供一種廉價的粘土礦物高嶺土固定的且具有優異酶學性能的固定化漆酶，以及相應提供該固定化漆酶的制備方法。

為解決上述問題，本發明采用以下技術方案：一種固定化漆酶及其制備方法，其特征在于，所述固定化漆酶是由高嶺土固定化漆酶制備得到；所述漆酶來自云芝，≥0.5units/mg；所述固定化漆酶的最適pH為4.5，最適溫度為40℃；所述固定化漆酶制備方法包括以下步驟。

（1）先將高嶺土置于100℃-120℃的條件下干燥4h-8h。

（2）將上述干燥好的高嶺土與漆酶溶液進行混合，所述漆酶溶液中的初始漆酶濃度為0.05mg/mL~2.0mg/mL，所述漆酶溶液的pH值為3.0~7.0；然后將高嶺土加入至所述漆酶溶液中，在25℃~35℃的溫度下、150rpm~300rpm轉速下對所述漆酶和高領土混合溶液振蕩15min~300min。

（3）將（2）中所得的固定化酶經過對應pH的緩沖溶液洗滌、5000rpm~10000rpm轉速離心分離、-100℃下冷凍和真空干燥20h~24h后即可。

上述的制備方法中，優選地，所述高嶺土置于120℃的條件下干燥6h。

上述的制備方法中，優選地，所述高嶺土與漆酶的混合液中高嶺土與漆酶的質量配比為1：（1~6）。

上述的制備方法中，優選地，所述步驟（2）中，所述漆酶溶液是由漆酶與檸檬酸緩沖液或磷酸緩沖液配制而成，所述檸檬酸緩沖液的pH值為3.0~6.0，所述磷酸緩沖液的pH值為7.0。