[發明專利]一種用于抑制蝦、牡蠣18SrDNA序列特異性擴增的引物及其應用

有效

• 申請號: 201711313711.4
• 申請日: 2017-12-12
• 公開（公告）號: CN108103059B
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 姜敬哲;戚認杰;劉聰;翟立廣
• 申請（專利權）人: 廣州鴻真生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;劉艷麗

本發明公開了一種用于抑制蝦、牡蠣18S rDNA序列特異性擴增的引物，所述的引物主要由如SEQ ID NO.1所示的堿基序列、在所述堿基序列AG之間插入的五個脫氧次黃嘌呤、以及在所述堿基序列末端的C3 spacer組成。該引物能夠有效抑制宿主基因的擴增，提高宿主體內其它真核生物(如原生動物、藻類、真菌)18S rDNA的擴增效果。本發明還公開了上述引物在制備具有抑制蝦、牡蠣18S rDNA序列特異性擴增功效的試劑中的應用。

技術領域

本發明屬于PCR引物技術領域，具體涉及一種用于抑制蝦、牡蠣18S rDNA 序列特異性擴增的引物及其應用。

背景技術

真核動物宿主(如牡蠣、蝦)的基因組中含有18S rDNA基因序列。同時，其體內(如腸道)也攜帶有多種真核微生物(如尚未消化的藻類食物、內共生真菌、寄生蟲)，它們基因組中也都含有18S基因序列，不同物種間的18S序列有一定相似性。

為了對宿主體內存在的真核微生物進行研究，人們通常采用PCR的方法通過 18S基因的通用引物進行特異性擴增。但是，由于不可避免的大量宿主自身18S 基因序列的干擾，使得這樣擴增后產物中宿主18S序列占據了絕大部分的比例，影響了研究結果。

抑制引物是根據真核宿主及真核微生物的18S rDNA的基因序列特征設計的一種特異性抑制宿主基因擴增的引物。通過添加抑制引物，能夠有效降低宿主基因序列的擴增效率，提高宿主體內其它真核生物(如原生動物、藻類、真菌)18S rDNA的擴增效果。

但是現有技術中還沒有用于抑制蝦、牡蠣18S rDNA序列特異性擴增的引物方面的研究報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于抑制蝦、牡蠣18S rDNA序列特異性擴增的引物，該引物能夠有效抑制宿主基因的擴增，提高宿主體內其它真核生物(如原生動物、藻類、真菌)18S rDNA的擴增效果。

本發明的目的還在于提供上述用于抑制蝦、牡蠣18S rDNA序列特異性擴增的引物在制備具有抑制蝦、牡蠣18S rDNA序列特異性擴增功效的試劑中的應用。

本發明的第一個目的是通過以下技術方案來實現的：一種用于抑制蝦、牡蠣18SrDNA序列特異性擴增的引物，所述的引物主要由如SEQ ID NO.1所示的堿基序列、在所述堿基序列AG之間插入的五個脫氧次黃嘌呤、以及在所述堿基序列末端的C3spacer組成。

該引物(簡稱：nmb-BP2-DPO)具體為：

GTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTCTA44444(4代表 dlnosine)GTGAGGGCAC(C3spacer)。

本發明的關鍵是設計一種對宿主18S基因擴增具有很好抑制效果的，同時又對其它微生物的18S基因擴增抑制很小的引物序列。

本發明的研究過程中設計了多條不同的抑制引物，并確定了兩種最有希望的設計方案，一種稱為C3間隔子，抑制引物的5’端與通用引物的正向或反向3’端有重疊(部分或全部)，然后以宿主序列延伸且3’端以化學修飾(C3spacer) 結束；另一種稱為雙引發寡核苷酸，同C3間隔子設計相似，主要是中間含有五個脫氧次黃嘌呤(dlnosine)連接5’端和3’端。為了驗證這些候選抑制引物的抑制效果，以不添加抑制引物的做為對照組，以添加抑制引物的作為檢驗組，通過瓊脂糖凝膠電泳，驗證了各種抑制引物的抑制效果。最后通過篩選確定了雙引發寡核苷酸引物。