[發(fā)明專利]一種臍血調(diào)節(jié)性T細胞體外擴增方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711305564.6
• 申請日: 2017-12-11
• 公開（公告）號: CN108004209A
• 公開（公告）日: 2018-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 付亞茹;孫陽陽;王洪星;曲廷瑜
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省齊魯干細胞工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 濟南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種臍血調(diào)節(jié)性T細胞體外擴增方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）細胞分離：新鮮臍血與PBS緩沖液1:1混合，緩慢加入等體積Ficoll淋巴細胞分離液中，密度梯度離心；收集單個核細胞白膜層，離心，棄上清液，獲得臍血單個核細胞沉淀，細胞沉淀用PBS緩沖液重懸，離心，棄上清液，獲得臍血單個核細胞；

（2）細胞培養(yǎng)：將步驟（1）制得的單個核細胞和細胞培養(yǎng)液混合，得到細胞懸液，接種至包被anti-CD3抗體的增殖培養(yǎng)皿中，添加Tregs細胞增殖培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)；

（3）細胞擴增培養(yǎng)：培養(yǎng)至第6天，將細胞轉(zhuǎn)移至不包被anti-CD3抗體的培養(yǎng)皿中，休整培養(yǎng)至第8天，將細胞再次轉(zhuǎn)移至包被anti-CD3抗體的Tregs細胞增殖培養(yǎng)皿中，體外擴增培養(yǎng)第14天，收取擴增后的細胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）中臍血單個核細胞接種密度為0.5-1×108/100mm 培養(yǎng)皿。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）、（3）中Tregs細胞增殖培養(yǎng)液為Gibco RPMI 1640培養(yǎng)液添加10% FBS、2000IU/ml IL-2、100ng/ml anti-CD28抗體、5ng/mlTGF-β，培養(yǎng)時每三天更換一次培養(yǎng)液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3）中休整培養(yǎng)時，細胞培養(yǎng)液為Gibco RPMI 1640培養(yǎng)液添加10% FBS，2000IU/ml IL-2。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）、（3）培養(yǎng)的條件為37℃、5% CO2及飽和濕度。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3）所述的細胞擴增后數(shù)量為起始細胞的1000-3000倍。