[發明專利]一種己糖激酶凍干粉的制備方法

有效

• 申請號: 201711301261.7
• 申請日: 2017-12-10
• 公開（公告）號: CN108048441B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 劉春卯;曹倩榮;鄭翔;秦艷梅;馬清河
• 申請（專利權）人: 河北省微生物研究所
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N9/12
• 代理公司: 石家莊海天知識產權代理有限公司 13101
• 代理人: 田文其

本發明屬于酶制劑的制備，特別是指一種己糖激酶凍干粉的制備方法。按照公開號為CN106479992A中的方法制備己糖激酶純酶液；在己糖激酶純酶液中加入蔗糖、乳糖、山梨醇作為凍干保護劑，使保護劑充分溶解并在酶液中分布均勻；預凍后置于真空冷凍干燥劑內冷凍干燥得到白色己糖激酶凍干粉。本發明解決了目前己糖激酶直接進行冷凍干燥導致的失活率高的問題，具有己糖激酶凍干粉酶活保存率高、相對液態己糖激酶酶性質較穩定、符合國標中對于試劑盒的使用要求且更利于保存等優點。

技術領域

本發明屬于酶制劑的制備，特別是指一種己糖激酶凍干粉的制備方法。

背景技術

在糖尿病的診斷、療效觀察和一般的臨床診斷中血清葡萄糖(GLU)檢測的應用非常廣泛。己糖激酶法因其干擾因素少，作用于α-D-葡萄糖能力很強，Km值很小，對底物親和力很強，配成成品試劑盒測定時間短，尤其適用于全自動分析儀，特別適用于急診檢驗使用，被認定是測定血清葡萄糖的參考方法。

己糖激酶在生產和使用的過程中，需要長期保存，液體狀態下4℃保存時間短，-20℃凍存會因反復凍融導致聚集、修飾、降解、污染等不良后果。己糖激酶冷凍干燥是將樣品在低溫下冷凍，然后在真空條件下，利用升華去除水分從而使樣品處于干燥狀態的單元操作。加入的凍干保護劑能夠取代水與蛋白結合，使蛋白的結構免遭破壞，保證了己糖激酶的穩定性。己糖激酶凍干粉在生物醫藥領域具有非常廣泛的應用前景，但目前國內己糖激酶的真空冷凍干燥技術尚不夠完善，己糖激酶直接進行冷凍干燥，失活率達99％以上，因此選擇合適的己糖激酶凍干保護劑至關重要。

己糖激酶作為診斷試劑盒配制中的關鍵酶，其酶性質決定了試劑盒品質的好壞，特別是己糖激酶的穩定性，直接影響診斷試劑盒的穩定性。在臨床化學體外檢測試劑(盒)的檢測標準中(GB/T 26124-2011)規定，穩定性是檢驗診斷試劑盒合格與否的重要指標，因此，制備穩定性高的己糖激酶是配制穩定性良好的診斷試劑盒的關鍵。

申請人檢索的國內外專利文獻情況如下：

申請人未曾查詢到關于己糖激酶凍干粉的制備方法的相關文獻報道。公開號為CN106932353A的專利文獻中公開了一種穩定的酶法肌酸激酶檢測診斷試劑盒，是通過R1和R2兩種試劑來完成診斷試劑盒的配制，其中己糖激酶是試劑R1的組成部分，但該文獻中未涉及己糖激酶凍干粉的制備。公開號為CN106868096A的專利文獻中公開了一種穩定性強且成本低的己糖激酶法葡萄糖檢測試劑，以己糖激酶為主要原料配制了一種穩定的低成本的液態己糖激酶法檢測血清葡萄糖檢測試劑，但該文獻中也未涉及己糖激酶凍干粉的制備。國內目前對己糖激酶的研究相對較少，申請人在公開號為CN106479992A的專利文獻中公開了診斷用己糖激酶的制備方法，是利用微生物菌株生產制備出了液態己糖激酶，但未涉及己糖激酶干粉的制備。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種己糖激酶凍干粉的制備方法，所制備的己糖激酶凍干粉失活率低且性質穩定，利于保存。

本發明的整體技術構思是：

一種己糖激酶凍干粉的制備方法，由如下工藝步驟組成：

A、按照公開號為CN106479992A中的方法制備酶活為200-300U/ml的己糖激酶純酶液；

B、在步驟A中制備的己糖激酶純酶液中加入3％-5％(m/v)蔗糖、1％-2％(m/v)乳糖、6％-8％(m/v)山梨醇作為凍干保護劑，置于4℃保存4-5h，使保護劑充分溶解并在酶液中分布均勻；

C、在預凍溫度為-20℃的條件下預凍12-14h，預凍后置于真空冷凍干燥劑內冷凍干燥16-20h，得到白色己糖激酶凍干粉，在-20℃保存。

目前國內對于己糖激酶酶活的檢測方法在國標及行業技術規范中未見說明，為驗證本發明所制備的己糖激酶凍干粉的酶活，申請人參照Sigma己糖激酶的測定方法進行酶活的檢測，具體步驟如下：