[發明專利]一種cry1A基因定性PCR檢測引物、檢測方法和檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201711296185.5
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN107868844A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 李亮;董美;宛煜嵩;金蕪軍;劉衛曉;蘭青闊;溫洪濤;武利慶;劉剛;柳方方;王迪
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司11279
• 代理人: 葉立濤,周際

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種cry1A基因定性PCR檢測引物、檢測方法和檢測試劑盒。

背景技術

Cry1A基因是一類抗蟲基因的總稱，也是當前商業化應用的抗蟲轉基因作物中最常見的外源目的基因，包括cry1Ab、cry1Ac、cry1A.105、mcry1Ac、cry1Ab/Ac等，cry1A基因在轉基因檢測工作中可作為一種具有廣泛代表性的靶標。但是，由于轉基因作物研發者往往會對cry1A基因進行序列改造或密碼子修飾，導致不同轉化體中的同一類型的cry1A基因在核苷酸序列上也有較大變異，因此，建立具有廣泛適用性的cry1A基因定性PCR檢測方法，對于轉基因作物的篩選檢測提供了一種高效的技術手段，為完善我國轉基因作物檢測手段具有十分重要的意義。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種cry1A基因定性PCR檢測引物；

本發明的目的之二是建立一種cry1A基因定性PCR檢測方法；

本發明的目的之三是一種cry1A基因定性PCR檢測試劑盒；

一種cry1A基因定性PCR檢測引物，所述定性檢測引物為：cry1A-aF，其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示；cry1A-aR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

一種抗蟲基因cry1A定性PCR檢測方法，按照如下步驟進行：

(1)DNA模板制備：提取待檢測樣品的DNA；

(2)試樣PCR反應：以提取樣品的DNA為模板，利用cry1A基因定性PCR檢測引物配置反應體系，并進行PCR擴增。

(3)對照PCR反應：在試樣PCR反應的同時，應設置空白對照、陰性對照和陽性對照。以水作為空白對照；以非轉基因玉米材料中提取的DNA作為陰性對照；以轉基因玉米MON810作為陽性對照。

(4)PCR產物電泳檢測及凝膠成像分析。

所述cry1A基因定性PCR反應體系為：2×Green Master Mix緩沖液12.5μL，10μmol/L cry1A-aF引物1μL，10μmol/L cry1A-aR引物1μL，25ng/μL DNA模板2μL，用去離子水補至25μL。

所述定性PCR反應的條件為：94℃變性5min；94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，進行35次循環；72℃延伸7min。

一種cry1A基因定性PCR檢測試劑盒，包括：2×Green Master Mix緩沖液、引物、陽性及陰性對照樣品、去離子水；所述引物的核苷酸序列為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

(1)序列比對：通過查詢網絡數據庫、國內外專利、科技論文等方式，收集不同轉基因作物中的cry1A基因序列，利用DNAMAN軟件進行序列比對分析，并設計引物對11種轉基因材料中的cry1A基因進行擴增，并測序驗證。

(2)引物設計：利用DNAMAN軟件對測序結果進行序列比對分析，根據比對結果，將cry1A基因分為4類，針對4類序列中相對保守部分，利用Primer premier 5.0軟件進行引物設計。采用簡并引物策略篩選出1對cry1A基因定性PCR檢測引物，cry1A-aF，其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示；cry1A-aR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。擴增產物大小為253bp。

(3)PCR反應體系和反應程序優化：用二因子正交試驗確定PCR反應體系中的引物終濃度和PCR反應程序中的退火溫度。根據正交試驗結果，確定最適合的PCR反應體系和反應程序。

(4)方法特異性測試：選取不同物種和相同物種不同品種的材料混合成測試樣品，對方法進行特異性測試。若僅從含有cry1A抗蟲基因材料中獲得預期擴增產物，而從其他樣品中未獲得預期擴增產物，表明方法特異性符合要求。

(5)方法檢出限測試：使用購買的歐盟標準物質，對含有cry1A抗蟲基因的4類材料(Bt11、MON810、Bt176、DAS-81419-2)不同質量分數的樣品進行測試，確定方法靈敏度。

(6)本發明進一步提供一種cry1A抗蟲基因定性PCR檢測試劑盒，包括：2×Green Master Mix緩沖液、引物、陽性及陰性對照樣品、去離子水；所述引物的核苷酸序列為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列。