[發明專利]一種磷酸化肽段和蛋白質富集方法和應用

在審

• 申請號: 201711294097.1
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN109897087A
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發明（設計）人: 張麗華;胡曄晨;江波;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22;G01N33/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種在中性條件下富集磷酸化肽段和蛋白質的方法，其特征在于：

(1)在磷酸化肽段和蛋白質標記上磷酸識別功能分子；

(2)利用葫蘆脲功能化硅球，富集標記了磷酸識別功能分子的磷酸化肽段和蛋白質；

(3)將磷酸化肽段和蛋白質洗脫，進行鑒定。

2.根據權利要求1所述的方法其特征在于：所述磷酸識別功能分子制備方法如下：

(1)采用3-溴丙酸制備羧基化的金剛烷銨；

(2)通過N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸與N,N′-二甲基吡啶胺反應形成支撐分子；

(3)將支撐分子與羧基化的金剛烷銨共價結合，并在其上絡合金屬離子，形成磷酸識別功能分子得到具有富集基團的功能分子。

3.根據權利要求1所述的方法其特征在于：所述葫蘆脲功能化硅球制備方法如下：

(1)葫蘆脲的羥基化修飾；

(2)羧基活化的硅球的制備；

(3)將葫蘆脲修飾于羧基活化的硅球上，得到葫蘆脲功能化硅球。

4.根據權利要求2所述一種在中性條件下富集磷酸化肽段和蛋白質的方法其特征在于：

所述采用3-溴丙酸制備羧基化的金剛烷銨的過程，如下：

(1)羧基化反應：將0.1-10當量1-金剛烷胺，簡稱為：AD1，0.1-10當量3-溴丙酸和0.1-10當量碳酸鉀懸浮于10-20體積份二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈、異丙醇、甲醇中的一種以上，混合物回流6-12h；

(2)后處理：將反應混合物經硅藻土過濾，并用乙腈充分洗滌；將濾液濃縮，殘余物通過硅膠柱色譜，二氯甲烷與甲醇體積比為9:1為流動相，進行純化，蒸干得到無色固體，簡稱為：AD1-APPA。

5.根據權利要求2所述一種在中性條件下富集磷酸化肽段和蛋白質的方法其特征在于：所述支撐分子的制備方法如下：

所述通過N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸與N,N′-二甲基吡啶胺反應形成支撐分子的過程為，通過N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸與N,N′-二甲基吡啶胺在多聚甲醛的存在下反應生成保護的前體分子，簡稱為：Boc-dpa，Boc-dpa去保護后得到支撐分子，簡稱為：dpa。

6.根據權利要求5所述的方法其特征在于：Boc-dpa去保護后得到支撐分子的制備方法如下：

所述Boc-dpa的制備過程：

(1)0.1-10當量N,N′-二甲基吡啶胺與0.1-10當量多聚甲醛溶解于20-50％異丙醇溶液中，用鹽酸調pH 8.0-9.0，50-90℃反應10-60min；

(2)向上述溶液中加入0.1-10當量N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，100-120℃反應6-24h，得到Boc-dpa；

(3)后處理：將異丙醇蒸干，冷卻至室溫后收集下層油狀物，分散于50體積份乙酸乙酯中，分別用飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液清洗，用硫酸鈉干燥過夜；以體積比為氯仿：三乙胺：甲醇＝20-50：0.8-1.2：0.1-0.5溶液為流動相，100-300目二氧化硅為固定相純化產物；

所述的Boc-dpa去保護生成dpa的過程：

將0.1-10當量Boc-dpa分散于1-10體積份二氯甲烷溶液中，滴加10-20體積份三氟乙酸，室溫反應1-12h得到dpa。