[發明專利]基于糖苷鍵質譜可碎裂型化學交聯劑的分析方法及應用

有效

• 申請號: 201711293824.2
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN109900814B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 張麗華;趙麗麗;趙群;高航;楊開廣;梁振;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/08;G01N30/72
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種基于糖苷鍵質譜可碎裂型化學交聯劑的分析方法，其特征在于：使用以二糖為骨架的含有兩個反應活性基團的交聯劑與組成蛋白質復合物的氨基酸殘基進行化學交聯反應，得到交聯蛋白，利用糖苷鍵和肽鍵質譜碎裂能量的選擇性差異，實現交聯試劑和交聯肽段肽鍵的高選擇性可控碎裂，從而降低交聯肽段的譜圖復雜程度并顯著縮減數據檢索的規模，實現基于化學交聯策略的蛋白質復合體的規?；治?，為研究蛋白質的空間結構及蛋白質-蛋白質相互作用網絡提供重要的技術支撐；所述交聯反應的特征在于：用于鑒定的蛋白質復合物的來源為：細胞蛋白質提取液、胞漿蛋白質提取液、血漿蛋白質提取液、組織蛋白質提取液、單一蛋白質復合物中的一種或二種以上；

所述交聯反應的特征在于：用于溶解蛋白質復合物的溶液為濃度為1mM到200mM的HEPES（羥乙基哌嗪乙硫磺酸）緩沖液，pH范圍為6.0到9.0；用于溶解交聯劑的溶劑為DMSO（二甲基亞砜）、DMF（二甲基甲酰胺）中的一種；發生交聯反應的蛋白質復合物的濃度為0.1到100mg/mL；發生交聯反應的交聯劑的濃度為0.1到50mM；發生交聯反應時有機相與水相的體積比為1：1000到10：1；交聯反應溫度為0到50℃；交聯反應時間為2min到48h；所述濃度均為終濃度。

2.根據權利要求1所述的基于糖苷鍵質譜可碎裂型化學交聯劑的分析方法，其特征在于：所使用的以二糖為骨架的交聯劑，含有兩個能與氨基酸殘基發生化學反應形成共價鍵的反應活性基團。

3.根據權利要求1所述的基于糖苷鍵質譜可碎裂型化學交聯劑的分析方法，其特征在于：所使用的以二糖為骨架的交聯劑，含有零個或一個能用于進行富集的功能性基團。

4.根據權利要求2所述基于糖苷鍵質譜可碎裂型化學交聯劑的分析方法，其特征在于：所述交聯劑的反應活性基團，包括氨基反應活性基團，巰基反應活性基團，光反應活性基團中相同的一種或不同的兩種；所述氨基反應活性基團為N-羥基琥珀酰亞胺酯、亞胺酸酯、碳化二亞胺中的一種或兩種以上；巰基反應活性基團為馬來酰亞胺；光反應活性基團為芳基疊氮、雙吖丙啶、二苯甲酮中的一種或者兩種以上。

5.根據權利要求1或3所述基于糖苷鍵質譜可碎裂型化學交聯劑的分析方法，其特征在于：所述交聯劑的富集基團，包括直接富集基團和間接富集基團；

所述的直接富集基團為生物素，間接富集基團為：烯基、炔基、疊氮中的一種或者兩種以上。

6.根據權利要求5所述的基于糖苷鍵質譜可碎裂型化學交聯劑的分析方法，其特征在于：所述間接富集基團是通過點擊化學反應引入直接富集基團，然后進行富集反應。

7.根據權利要求1所述的基于糖苷鍵質譜可碎裂型化學交聯劑的分析方法，其特征在于：所述交聯蛋白，經過高溫或高濃度鹽溶液條件變性、（三(2-羧乙基)膦 鹽酸鹽）或二硫蘇糖醇還原、碘代乙酰胺烷基化及酶解步驟得到肽段樣品；

所得到的肽段，若為通過不含有富集功能基團的交聯劑反應得到，則應用于通過強陽離子交換、體積排阻色譜的方式對含有蛋白質相互作用信息的交聯肽段進行富集；

所得到的肽段，若為含有富集功能基團的交聯劑反應得到，則應用于通過富集反應，將含有富集功能基團的肽段富集。

8.根據權利要求7所述的基于糖苷鍵質譜可碎裂型化學交聯劑的分析方法，應用于將經富集得到的肽段樣品進行液相色譜聯用質譜分析，質譜采集模式為二級質譜或三級質譜；二級質譜采集模式中第二級質譜碎裂模式為CID、ETD、HCD、EThcD中的一種或二種以上聯用；三級質譜采集模式中第二級質譜碎裂模式為CID、ETD、HCD、EThcD中的一種或二種以上聯用，對具有特征質荷比差異的碎片離子進行三級質譜鑒定或對信號強度從高到低前1到200的碎片離子進行三級質譜鑒定；不同碎裂模式的碎裂能量范圍為2%到80%；在采用三級質譜鑒定方式時，二級質譜碎裂模式的碎裂能量選擇優先斷裂糖苷鍵的碎裂方式，三級質譜選擇適合肽段肽鍵碎裂的模式和能量。

9.根據權利要求7所述基于糖苷鍵質譜可碎裂型化學交聯劑的分析方法，其特征在于：所述方法使用以二糖為骨架的含有兩個反應活性基團的交聯劑與蛋白質復合物進行化學交聯反應，利用糖苷鍵和肽鍵質譜碎裂能量的選擇性差異，應用于交聯試劑和交聯肽段肽鍵的高選擇性可控碎裂，從而降低交聯肽段的譜圖復雜程度并顯著縮減數據檢索的規模，應用于基于化學交聯策略的蛋白質復合體的規模化分析，研究蛋白質的空間結構、構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡。