[發(fā)明專利]全人源抗PDL-1單鏈抗體B129及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711292207.0
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN107880127B
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 詹金彪;穆罕默德·卡利姆;林才瑤;汪勝豪;梁可瑩
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/13;A61K39/395;A61K47/68;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

本發(fā)明提供一種全人源抗PDL?1單鏈抗體B129，其DNA序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明提供的單鏈抗體B129是從已構(gòu)建的全人源白血病噬菌體單鏈抗體庫中篩選出能夠特異結(jié)合于胞外區(qū)PDL?1蛋白的單鏈抗體。其結(jié)構(gòu)簡單，是抗體重鏈可變區(qū)V_H和輕鏈可變區(qū)V_L由連接肽連接而成，MW為30?34kD，且含有完整抗原結(jié)合部位；對PDL?1陽性的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生生長抑制作用；該單鏈抗體分子量小、穿透性強(qiáng)、免疫源性低，是一種理想的藥物運(yùn)輸載體，可作為藥物或藥物載體運(yùn)輸藥物、同位素或毒素蛋白，為治療PDL?1陽性的癌癥提供有效的手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬基因工程，涉及全人源抗PDL-1單鏈抗體B129的篩選、鑒定和原核表達(dá)，及其在靶向藥物制備中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

噬菌體展示抗體技術(shù)可以制備全人源的抗體，是將蛋白分子或肽段的基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，與噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，從而使異源分子展示于噬菌體表面。主要特點(diǎn)是將特定的分子的基因型和表達(dá)型同時出現(xiàn)在一個噬菌體顆粒內(nèi)，通過DNA測序可以獲得特定展示蛋白的序列信息。

噬菌體抗體庫技術(shù)模擬了人類B細(xì)胞的分化成熟過程，首先通過分子生物學(xué)手段將人類抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因連接起來形成單鏈抗體(Single-chain variablefragment,scFv)，插入噬菌體載體上，使單鏈抗體scFv展示在噬菌體表面，再用特定的抗原篩選出特異性的噬菌體抗體，并用大腸桿菌表達(dá)可以表達(dá)大量單鏈抗體。

噬菌體可以表達(dá)抗體結(jié)合片段(Fragment antigen binding,Fab)、單鏈抗體(scFv)、雙鏈抗體(Diabody)和雙特異性抗體(Bispecific scFv,BsAb)等。其中單鏈抗體scFv是目前報道最多的一種小分子抗體，是由抗體識別抗原的可變區(qū)Fv段組成。Fv由重鏈可變區(qū)V_H和輕鏈可變區(qū)V_L通過連接肽(linker)連接構(gòu)成scFv。所加的linker很重要，必須不影響Fv的構(gòu)象，目前最常用的是由四個甘氨酸和一個絲氨酸組成的重復(fù)3次的序列(GGGGS)₃。將scFv基因克隆在絲狀噬菌體載體pIII基因先導(dǎo)序列和pIII基因之間，以融合蛋白的形式被導(dǎo)入細(xì)菌膜間隙，并組裝成scFv，在加入輔助噬菌體M13K07后，scFv以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體表面。pCANTAB-5E載體的特點(diǎn)是，在scFv基因后面含有一段編碼Tag尾肽(E-Tag)的序列，在E-Tag后面有一個琥珀(Amber)終止密碼子，位于scFv基因與pIII基因之間，在抑制性細(xì)菌TG1中，這種琥珀密碼子只有20％有效，所以在蛋白翻譯過程中可以被通讀而形成scFv-pIII融合蛋白；而在非抑制性菌株中，如HB2151，此終止子被識別，同時scFv基因在pIII基因前終止，形成獨(dú)立的抗體蛋白，滯留于細(xì)胞膜間隙，并在長時間培養(yǎng)后釋放于培養(yǎng)液中，形成可溶性表達(dá)。

單鏈抗體scFv具有結(jié)構(gòu)簡單、相對分子量小、穿透性強(qiáng)、免疫源性低等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的載體。構(gòu)建全人源抗體庫目的是尋找一種能與特定白血病相關(guān)抗原(如PDL-1等)特異性結(jié)合的單鏈抗體scFv，這類特異識別腫瘤細(xì)胞的單鏈抗體本身或者其可變區(qū)序列，經(jīng)過基因工程改造成其它的抗體形式后，可以作為抗腫瘤藥物進(jìn)行開發(fā)；其次可以作為藥物載體，如偶聯(lián)藥物、毒素或放射性同位素，進(jìn)行腫瘤靶向治療。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種基因重組的全人源抗PDL-1單鏈抗體B129。是從已構(gòu)建的全人源白血病噬菌體單鏈抗體庫中篩選出能夠特異結(jié)合于胞外區(qū)PDL-1蛋白的單鏈抗體。

本發(fā)明提供的一種全人源抗PDL-1單鏈抗體B129，具有結(jié)構(gòu)簡單、相對分子量32.6kDa、穿透性強(qiáng)、免疫源性低等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的藥物運(yùn)輸載體。

所述全人源抗PDL-1單鏈抗體B129的DNA序列如SEQ ID No.1所示：