[發明專利]利用懸浮培養的地黃莖形成層干細胞生產梓醇的方法

有效

• 申請號: 201711291264.7
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN108034681B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 周鵬飛;李海華;劉友才;張偉;閆思涵;謝永生;張毅敏;史世強
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12P19/60
• 分類號: C12P19/60;C12N5/04
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 韓曉娟

本發明公開了一種利用懸浮培養的地黃莖形成層干細胞生產梓醇的方法，具體包括：以地黃屬植物莖為外植體，通過誘導培養、分離培養和繼代培養建立穩定生長的地黃形成層干細胞培養體系；然后于生物反應器中加入聯合誘導子β?CD和茉莉酸甲酯進行懸浮培養，之后經超聲提取、大孔樹脂吸附、高效液相制備柱進行精制后得到高純度的梓醇。本發明利用的植物干細胞培養體系具有同步生長、遺傳性狀穩定、生長速度快、梓醇合成穩定等優良特性，其作為制備梓醇的原料，為梓醇的制備提供了一種新方法；此外，與化學合成相比，本發明利用生物反應器培養技術結合植物干細胞培養技術生產高純度梓醇，具有生產周期短，安全性高，成本低，產量高，低污染等優點。

技術領域

本發明屬于醫藥生物工程技術領域，特別涉及一種利用懸浮培養的地黃屬植物莖形成層干細胞生產梓醇的方法。

背景技術

地黃是我國最著名的中藥材之一，據統計，約有80多種中成藥以生地黃為主要原料，如六味地黃丸、知柏地黃丸、烏雞白鳳丸、消糖丸等。梓醇是地黃中主要活性成分之一，具有廣泛的藥理活性，如降血糖、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、神經保護等。2017年1月25日，青海央宗藥業有限公司自主研發的“梓醇片”取得國家食品藥品監督管理局中藥一類藥物臨床試驗批件。

地黃生長周期較長，且易受生長環境的影響，連續種植的地黃，地下根莖多為須根，無法形成膨大的具備要用價值的塊莖，只能間隔8-10年后才能種植。連作障礙已經成為制約地黃種植生產亟待解決的難題。河南焦作是懷地黃的道地產區，隨著種植面積的不斷增加，較多地區出現無新地可供種植，輪作年限嚴重縮短的情況，嚴重制約了地黃的產量及質量。此外，地黃植物中梓醇含量較低(1噸干重的熟地黃中僅能提取得到2g的梓醇)，化學組分復雜，提取分離純化的成本較高。

19世紀30年代，科學家首次建立了離體培養植物細胞的培養技術。經過80年的發展，植物生物技術得到了長足的發展，利用植物細胞培養技術生產重要活性次生代謝產物得到越來越多科學家的關注，并已有一些成功實現工業化生產的案例，如利用生物反應器技術懸浮培養紅豆杉脫分化細胞可工業化生產紫杉醇，利用懸浮培養的黃連脫分化細胞可工業化生產小檗堿，利用懸浮培養的彩葉草脫分化細胞可工業化生產迷迭香酸等。

當前所使用的植物細胞培養技術多以離體的莖、根、葉等為細胞來源，這種方式獲得的細胞均為脫分化細胞。在離體細胞的獲得過程中，細胞易發生有害的表觀遺傳變異和基因變異或缺失，經過長期培養后細胞生長變慢，次生代謝產物的種類和含量逐漸下降。因此，建立遺傳信息穩定，經長期培養后仍然保持較高的生長速率和較高產量次生代謝產物的細胞培養體系是植物細胞培養亟待解決的首要問題。

植物干細胞是一種原始的、未分化的，具有全能性或多能性的細胞，它可以分化成多種細胞類型或組織器官。植物干細胞為根、莖和葉等器官的形成及再生源源不斷的提供新細胞，并貫穿植物的整個生命周期。植物干細胞存在于植物的莖頂端分生組織、根尖分生組織和維管形成層。植物維管束形成層為干細胞提供小生境，并維持多能干細胞的數量和功能。

2010年，韓國云火科學院的科學家從野生的紅豆杉枝條中分離培養了紅豆杉形成層分生組織細胞，經穩定化培養后獲得紅豆杉干細胞培養體系，其紫杉醇含量高達264mg/kg，并可實現3噸規模的工業化生產。利用現有的植物細胞培養技術獲得的地黃脫分化細胞梓醇含量較低，且不能長期穩定的用于工業化生產活性次生代謝產物。

發明內容

為解決目前地黃脫分化細胞梓醇含量較低的缺陷，本發明的目的在于提供一種利用懸浮培養的地黃莖形成層干細胞長期穩定生產梓醇的方法，該方法具有生產周期短、環境友好、可持續性強、產量高且穩定等特點。

本發明提供的利用懸浮培養的地黃莖形成層干細胞生產梓醇的方法，具體包括如下步驟：

S1：以地黃屬植物莖為外植體，對外植體進行滅菌，通過誘導培養、分離培養和繼代培養建立穩定生長的地黃莖形成層干細胞培養體系；