[發明專利]一種食源性化膿鏈球菌LAMP引物組及試劑盒與應用

有效

• 申請號: 201711287868.4
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN108220460B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 周臣清;張娟;黃寶瑩;趙玲;范安妮;佘之蘊
• 申請（專利權）人: 廣東產品質量監督檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

1.一種食源性化膿鏈球菌的LAMP引物組，其特征在于，包括外引物spy1258-F3和spy1258-B3，內引物spy1258-FIP和spy1258-BIP；以化膿性鏈球菌轉錄調控基因spy1258作為靶基因，用于定性檢測食品及食品接觸材料中的化膿鏈球菌，其引物核苷酸序列如下所示：

spy1258-F3：CCTTACTAAAAAGGCTGGTATC

spy1258-B3：GAGTTGCGGAAATTTGAGG

spy1258-FIP：TCCAGAGTGTCATTTTTGAAGTGAT-AATAGAGGAACCTTCTACCTCC

spy1258-BIP：TCAGGCTGAAATCTACACAGACAC-GCGGTTATAAATTCTCTATGTTCT。

2.一種用于定性檢測食品及食品接觸材料中的化膿鏈球菌的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述食源性化膿鏈球菌的LAMP引物組。

3.根據權利要求2所述試劑盒，其特征在于，內引物與外引物的摩爾比為1:8。

4.根據權利要求3所述試劑盒，其特征在于，還包括DNA聚合酶、2×反應緩沖液、密封液、熒光染料、陽性對照、陰性對照。

5.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μL。

6.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，2×反應緩沖液包含buffer緩沖液、甜菜堿和dNTPs，三者體積比為10:8:7。

7.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，熒光染料為濃度10×SYBR Green I；所述密封液為礦物油。

8.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，陽性對照為化膿鏈球菌標準菌株基因組DNA；陰性對照為滅菌去離子水。

9.一種權利要求1所述食源性化膿鏈球菌LAMP引物組或權利要求2～8任意一項所述試劑盒在定性檢測食品及食品接觸材料中化膿鏈球菌的應用。

10.一種應用權利要求3～8任一所述試劑盒檢測食品及食品接觸材料中化膿鏈球菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）提取待測物DNA：食品樣品前處理遵從GB 4789 .11-2014，即取25g或25mL待檢樣品置于無菌均質袋中，加入225mL改良胰蛋白胨大豆肉湯培養基（mTSB）中，均質1～2min；或加入盛有225mL mTSB的均質杯中，以8000 r/min～10000 r/min均質1min~2min；食品接觸材料前處理采用無菌生理鹽水濕潤棉拭子，分別在2個25 cm²面積范圍來回均勻涂抹整個方格3次后，用滅菌剪刀剪去棉拭子與手接觸的部分，置10mL mTSB內，均質；36℃±1培養18～24h，取200μL培養過的菌液于干凈的1.5mL離心管中，100℃煮沸10min，12000 rpm離心10min，取上清，-20℃保存備用；

（2）采用25μL反應體系：內引物spy1258-FIP和spy1258-BIP各1.6μM，spy1258-F3和spy1258-B3各0.2μM，2×反應緩沖液12.5μL，DNA聚合酶8U，熒光染料為0.5μL，待檢樣品2μL，加超純水至25μL；混勻后，加入一滴密封液，混勻離心，置于62.5℃反應45min；

（3）檢測結果判斷：將含有上述反應體系的反應管放入熒光PCR儀中，根據是否出現擴增曲線來判斷檢測結果：若出現“S”型擴增曲線則檢測結果為陽性，即樣品中含有化膿鏈球菌；若無“S”型擴增曲線出現則檢測結果為陰性，即樣品中不含化膿鏈球菌。