[發(fā)明專利]一種利用碳基納米材料提升細菌群落多樣性檢測準(zhǔn)確性的方法

在審

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• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN108060219A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧曄;厲舒幀;宋茂勇
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京風(fēng)雅頌專利代理有限公司 11403
• 代理人: 張擁

本發(fā)明公開了一種利用碳基納米材料提升細菌群落多樣性檢測準(zhǔn)確性的方法，包括以下步驟：(1)采集細菌群落樣本，提取細菌群落樣本的16SrRNA基因，并根據(jù)細菌群落樣本的16SrRNA基因設(shè)計并合成上下游引物；(2)將碳基納米材料與PCR擴增反應(yīng)體系混合均勻，并利用上下游引物擴增細菌群落樣本的16SrRNA基因；(3)PCR產(chǎn)物分離純化后，構(gòu)建文庫后進行高通量測序，對測序數(shù)據(jù)進行處理后，分析嵌合體數(shù)量并去除嵌合體序列，然后對非嵌合體序列進行比對，確定錯配序列的數(shù)量。本發(fā)明的碳基納米材料能夠減少細菌群落多樣性檢測過程嵌合體及錯配堿基的產(chǎn)生，從而提升細菌群落多樣性檢測的準(zhǔn)確性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用碳基納米材料提升細菌群落多樣性檢測準(zhǔn)確性的方法，該方法能夠減少細菌群落多樣性檢測過程中嵌合體及錯配堿基的產(chǎn)生，進而提升針對土壤、水體或大氣等各種環(huán)境中細菌群落檢測的準(zhǔn)確性。

背景技術(shù)

目前對于細菌群落多樣性研究一般都遵循采樣、提取DNA、擴增16srRNA基因、高通量測序的方法進行。PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，是指在體外選擇性擴增DNA片段的技術(shù)。每次擴增都以上次擴增的產(chǎn)物作為模板進行指數(shù)擴增。PCR技術(shù)主要分為三個基本反應(yīng)步驟，即變性-退火-延伸(Scharf,S.J.,G.T.Horn and H.A.Erlich(1986).DirectCloning and Sequence-Analysis of Enzymatically Amplified Genomic Sequences.Science 233(4768):1076-1078.)。變性階段雙鏈DNA經(jīng)過高溫變性后解鏈成單鏈；退火階段引物與單鏈DNA在較低溫度下堿基互補配對；延伸階段引物與模板結(jié)合物以脫氧核糖核苷酸(dNTP)為原料，按照半保留復(fù)制與堿基互補配對的原則合成一條與模板鏈互補的新鏈。不斷循環(huán)這三個過程即可在短時間內(nèi)將目的片段擴增數(shù)百萬倍。目前，PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物領(lǐng)域的研究。

但是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)過程中會產(chǎn)生較多測序錯誤，如嵌合體和錯配序列等等。其中產(chǎn)生嵌合體的原因包括模板的特異性、PCR的循環(huán)數(shù)、序列的相似性等因素(Lahr,D.J.G.and L.A.Katz(2009).Reducing the impact ofPCR-mediated recombination in molecular evolution and environmental studiesusing a new-generation high-fidelity DNA polymerase.Biotechniques 47(4):857-863；Haas,B.J.,D.Gevers,A.M.Earl,M.Feldgarden,D.V.Ward,G.Giannoukos,D.Ciulla,D.Tabbaa,S.K.Highlander,E.Sodergren,B.Methe,T.Z.DeSantis,J.F.Petrosino,R.Knight,B.W.Birren and H.M.Consortium(2011).Chimeric 16S rRNA sequenceformation and detection in Sanger and 454-pyrosequenced PCR amplicons.Genome Research 21(3):494-504.)。而其中最普遍的原因是模板的不完全擴增，即在PCR過程中兩個部分延伸的序列進行結(jié)合。在下一輪擴增過程中這種序列也作為模板進行復(fù)制，就產(chǎn)生了大量不真實的序列。