[發明專利]一種抗凋亡的CHO細胞株及其用途

在審

• 申請號: 201711287461.1
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN108070565A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 郭鳳祥;趙柏松
• 申請（專利權）人: 珠?；羝战鹚贯t藥研究院股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;A61K35/54;A61P43/00
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 張曉俊

1.一種抗凋亡的CHO細胞株，其特征在于，含有Bcl2/shRNA-Caspase3表達盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的抗凋亡的CHO細胞株，其特征在于，所述細胞株構建方法包括以下步驟：

(1)構建Bcl2和shRNA-Caspase3雙表達質粒pCHO/Bcl2/shRNA-Caspase3；

(2)將pCHO/Bcl2/shRNA-Caspase3轉染懸浮CHO細胞株；

(3)在CD-Forti+Puromycin+MXT篩選培養基中進行加壓篩選，得到混合克隆細胞；

(4)培養混合克隆細胞，挑取單克隆細胞；

(5)檢測所述步驟(4)得到的單克隆細胞Bcl2表達量和Caspase3表達量，篩選得到所述抗凋亡的CHO細胞株。

3.根據權利要求2所述的抗凋亡的CHO細胞株，其特征在于，所述步驟(1)所述的Bcl2和shRNA-Caspase3雙表達質粒pCHO/Bcl2/shRNA-Caspase3的構建方法包括以下步驟：

(1-1)采用RT-PCR法獲取鼠Bcl2基因的cDNA序列，插入到pCHO1.0載體中，得到重組質粒pCHO/Bcl2；

(1-2)在鼠Caspase3基因外顯子區的siRNA序列中選擇siRNA結合位點序列；

(1-3)為所述步驟(1-2)的siRNA結合位點序列設計相應的shRNA引物，將引物連接到載體pSilencer2.1構建pS/shCaspase3重組質粒；

(1-4)所述步驟(1-3)所述的pS/shCaspase3重組質粒分別轉染到CHO細胞；

(1-5)檢測Caspase3基因的表達，評價siRNA結合位點序列的沉默效率，挑選出目標siRNA序列；

(1-6)將所述目標siRNA序列對應的pS/shCaspase3重組質粒上的U6-shCaspase3表達盒插入到所述步驟(1-1)所述重組質粒pCHO/Bcl2中，構建質粒pCHO/Bcl2/shRNA-Caspase3。

4.根據權利要求3所述的抗凋亡的CHO細胞株，其特征在于，所述步驟(1-1)所述RT-PCR法的反應體系為：PrimeScript 1Step Enzyme Mix、2×1StepBuffer、上引物、下引物與Template RNA；反應條件為在40-60℃反應20-40min，90-100℃反應1-3min；條件1：98℃反應10sec，條件2：68℃反應1min，條件1和條件2交替進行，循環25～30次。

5.根據權利要求3所述的抗凋亡的CHO細胞株，其特征在于，所述步驟(1-2)中所述siRNA結合位點序列選自siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3和siRNA-4。

6.根據權利要求5所述的抗凋亡的CHO細胞株，其特征在于，所述siRNA-1的引物序列為shRNA-1UP與shRNA-1LO；siRNA-2的引物序列為shRNA-2UP與shRNA-2LO；siRNA-3的引物序列為shRNA-3UP與shRNA-3LO；siRNA-4的引物序列為shRNA-4UP與shRNA-4LO。

7.根據權利要求4所述的抗凋亡的CHO細胞株，其特征在于，所述上引物序列：TTACCTAGGATGGCGCAAGCCGGGAG；所述下引物序列：TAGGTATACAGCTACTTGTGGCCCAGGTA。

8.根據權利要求3所述的抗凋亡的CHO細胞株，其特征在于，所述步驟(1-1)所述RT-PCR法獲取的鼠Bcl2基因的cDNA序列以限制性內切酶BamHI和HindIII雙酶切，并與同樣雙酶切的pCHO1.0載體相連接，連接體系為：pCHO1.0線性化載體、酶切回收的Bcl2基因、T4連接酶與buffer，20-25℃反應1-3h，之后加入感受態細胞，40-45℃熱激50-70s，轉化得到重組質粒pCHO/Bcl2。