[發明專利]一條可與頭孢喹肟特異性結合的核酸適配體及其篩選方法

在審

• 申請號: 201711286767.5
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN107916265A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 李灝;王楚楚;王麗慧
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司11203
• 代理人: 劉萍

技術領域

本發明屬于食品安全與抗生素檢測領域，特別涉及到利用分子生物學技術中的SELEX技術(指數富集的配基系統進化技術)篩選一條能與頭孢喹肟特異性結合的核酸適配體及其篩選方法。為該核酸適配體在食品、藥品及生物制品中頭孢喹肟的監管和分析檢測等方面的應用提供科學依據和理論基礎。

背景技術

進入二十一世紀以來，我國的畜牧業迅速發展。近年來國家相繼出臺的各種惠農政策，加大了養殖業的資金和政策扶持力度。為了降低牛、豬等動物的發病率與死亡率，提高飼料利用率和改善產品的質量，抗生素在畜牧業中的使用越來越廣泛。隨著經濟的發展，人們生活水平的提高，各種牛羊肉、奶制品、家禽、蛋等動物源性食品的消費也越來越大。因此，嚴格控制動物源性食品安全，對消費者的健康具有非常重要的意義。頭孢喹肟屬于內酰胺類抗生素，又名頭孢喹咪、頭孢喹諾，是目前唯一一個動物專用第4代獸用頭孢菌素類抗生素。其抗菌譜廣、抗菌活性強、吸收快、毒副作用小和生物利用度高，國內外已廣泛批準將其應用于豬、牛呼吸道和奶牛乳房炎等細菌感染的臨床治療。然而，養殖業中濫用抗生素，經常會導致其肉制品和乳制品中含有頭孢喹肟抗生素殘留，經食物鏈被人類食用后，會導致腹瀉、嘔吐等腸道疾病，嚴重者還會導致器官衰竭甚至死亡。由于它廣泛存在于日常生活的食品、藥品和生物制品中，嚴重危害了產品質量和人民的健康安全。

目前，傳統檢測頭孢喹肟的方法主要有微生物檢測法，如紙片法、氯化三苯基四氮唑試驗即TTC法、戴爾沃檢測法；高效液相色譜法(HPLC)；免疫分析法等。但是這些方法檢測耗時長、靈敏度低，不能滿足快速靈敏的市場需求。同時，其中有些方法容易受到蛋白酶等的影響而導致結果不準確。因此發展新的檢測方法十分重要。

核酸適配體是指能夠與目標分子特異性、高親和地結合的單鏈寡聚DNA 或RNA，一段由20-90個堿基組成。它是上世紀90年代發展起來的一種新的組合化學技術---體外指數富集配體系統進化(SELEX)技術得到的。作為一種新型的仿生識別分子，核酸適配體能特異性的識別并緊密結合各種靶分子。與抗體-抗原的特異性識別相似，但是與抗體-抗原相比，它具有更多的優勢，如高親和力，活性穩定、易修飾、成本低、制備簡單和變性與復性可逆等特點。并且不僅限于與蛋白質的特異性結合，其靶分子范圍包括藥物分子、氨基酸、金屬離子、各種微生物和細胞等。近年來在食品安全、食品檢測和疾病治療等方面的應用引起了廣泛關注。

經過近幾十年的發展，已經開發了各種各樣的SELEX技術，如CE-SELEX、 Magnetic-SELEX、Capture-SELEX和Cell-SELEX等。本發明基于 Magnetic-SELEX技術，以頭孢喹肟為靶分子，通過正向篩選和反向篩選過程，制備了高特異性和親和力的頭孢喹肟核酸適配體。該方法具有操作簡便、篩選過程成本低的優勢。所獲得的核酸適配體具有穩定性強、合成方便和易于標記等特點，能用于食品和藥品等多方面的分析檢測。

發明內容

本發明的目的在于克服現有檢測技術的不足，提供一種具有比蛋白抗體更高親和特異性、無免疫原性、能夠化學合成的、分子量小且性質穩定的可用于檢測頭孢喹肟的核酸適配體。本發明采用Magnetic-SELEX技術，以頭孢喹肟為靶分子，以氨芐青霉素為反向篩選靶標，篩選出與頭孢喹肟特異性結合的核酸適配體。

上述目的通過以下技術方案實現：

1.合成以下序列所示的ssDNA文庫和引物：

ssDNA文庫：

5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；

上引物：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’；

下引物：5’–biotin-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’。

2SELEX技術篩選特異性核酸適配體

SELEX技術篩選全過程所用的：2×SELEX結合液終濃度組成為:20mM Tris–HCl，2mM MgCl₂，5mM KCl，1mM CaCl₂，100mM NaCl，每100ml 2×SELEX 結合液加12.5ul的Tween 20，pH 7.6.(1×SELEX結合液即把2×SELEX結合液稀釋1倍)

清洗液終濃度組成為：40mM Tris–HCl，10mM EDTAS，3.5M尿素，每 100ml SELEX清洗液中加12.5ul Tween 20Ph＝7.35