[發明專利]用于抑制梨果實采后青霉病的制劑GS115/Ace-AMP1

有效

• 申請號: 201711286501.0
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN108018221B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 余挺;林明;黃伊寧;鄭曉冬
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/29;C12N15/81;A23B7/155;C12R1/84
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發明公開了一種用于抑制梨果實采后青霉病的制劑GS115/Ace?AMP1，為導入Ace?AMP1抗菌肽之后的重組畢赤酵母GS115/Ace?AMP1。重組畢赤酵母GS115/Ace?AMP1的構建方法為包括以下步驟：將優化后的Ace?AMP1基因通過Xho I和Not I雙酶切以及T4連接酶構建到pPICZαA載體上，將pPICZαA/Ace?AMP1重組表達載體線性化酶切后，電轉化GS115感受態細胞中，在含有Zeocin抗性平板中挑取單菌落PCR和測序驗證，得到重組畢赤酵母GS115/Ace?AMP1菌株。本發明能用于抑制果實采后病害的保鮮。

技術領域

本發明涉及果實采后病害防治技術領域，更具體的是一種在畢赤酵母GS115中轉化和過表達Ace-AMP1抗菌肽提高其對果實病害的防治技術。

背景技術

現階段主要采用化學殺菌劑的方法來防治果蔬菜后病害，然而過度使用化學殺菌劑會危害人體健康、造成環境污染以及產生抗藥性等問題。當前，歐盟已禁止化學殺菌劑在核果類果實中的應用，因此尋找安全無毒、環境友好和高效抑菌的化學殺菌劑替代品成為現階段迫切需求。

將拮抗微生物用于果實采后病害的生物防治被視為最有可能替代化學殺菌劑的方法之一，拮抗酵母具有安全無毒、使用方便以及遺傳穩定等優點使其商品化運用成為可能。但目前拮抗微生物的生物防治效果仍無法達到或接近化學殺菌劑，因此為進一步提高拮抗酵母的生防效果，研究者們進行了多種嘗試，包括逆境脅迫處理、培養條件優化、逆境條件分離拮抗菌種以及表達外源基因等，其中隨著分子技術的高速發展，將表達產物具有直接抑菌效力以及能提高拮抗微生物抗逆性等外源基因定向轉化拮抗酵母逐漸成為生物防治領域的研究熱點。畢赤酵母具有遺傳操作簡單、外源基因表達水平高且穩定、表達產物可加工及修飾等特點受到研究者青睞，目前已有多種抗菌肽在畢赤酵母中成功表達。

抗菌肽作為一種生物體特定基因編碼產生的一類小分子多肽，對細菌具有高效光譜的殺滅能力，同時對病原真菌、病毒、原蟲等也具有較強抑制作用。Ace-AMP1抗菌肽是來自于洋蔥(Allium cepa L)種子中一種富含堿性精氨酸的多肽物質，已被證實對人體細胞沒有毒害作用，且對病原真菌抑制效果顯著，其中對鏈格孢菌(Alternaria brassicola)的半抑制濃度(IC₅₀)低至2.5μg/mL，對灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的半抑制濃度(IC₅₀)低至3μg/mL。

Ace-AMP1抗菌肽目的基因(即，原始的Ace-AMP1基因)在A Potent AntimicrobialProtein from Onion Seeds Showing Sequence Homology to Plant Lipid TransferProteins中被公開；其序列為：

CAGAACATATGCCCAAGGGTTAATCGAATTGTGACACCCTGTGTGGCCTACGGACTCGGAAGGGCACCAATCGCCCCATGCTGCAGAGCCCTGAACGATCTACGGTTTGTGAATACTAGAAACCTACGACGTGCTGCATGCCGCTGCCTCGTAGGGGTAGTGAACCGGAACCCCGGTCTGAGACGAAACCCTAGATTTCAGAACATTCCTCGTGATTGTCGCAACACCTTTGTTCGTCCCTTCTGGTGGCGTCCAAGAATTCAATGCGGCAGGATTAACCTTACGGATAAGCTTATATACTTGGACGCTGAGGAA。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種不借助化學殺菌劑的前提下，利用導入Ace-AMP1抗菌肽基因后的重組畢赤酵母GS115/Ace-AMP1抑制果實采后病害的保鮮技術。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種用于抑制梨果實采后青霉病的制劑GS115/Ace-AMP1：為導入Ace-AMP1(優化后的Ace-AMP1)抗菌肽之后的重組畢赤酵母GS115/Ace-AMP1。