[發明專利]一種基于肽段C末端選擇性酶標記的質譜從頭測序方法

有效

• 申請號: 201711282055.6
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN109900834B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 張麗華;吳瓊;單亦初;楊超;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種基于肽段C末端選擇性酶標記的質譜從頭測序方法及其應用。所述的方法是在肽段C末端酰胺酶的催化作用下，肽段C末端的羧基直接通過酰胺化反應標記上帶堿性基團的小分子或者先通過酰胺化反應標記上帶氨基的不飽和烴類，進一步通過疊氮?炔基或者巰基?烯的點擊化學反應連接上堿性功能分子。肽段C末端標記上的堿性分子增加二級質譜中y離子的數目，提高肽段在質譜中的響應和碎裂效率，從而實現肽段測序。

技術領域

本發明涉及一種基于肽段C末端選擇性酶標記的質譜從頭測序方法及其應用。

背景技術

多肽是蛋白質的重要組成單元，廣泛存在于生命系統中，在細胞分裂、生長等各領域發揮著重要作用。以多肽作為藥物是近年藥物市場研發的趨勢之一，目前全球批準上市的多肽藥物已超過80余種。然而很多活性多肽或者新開發的多肽藥物的序列是未知的，對多肽以及多肽藥物的測序有利于了解多肽的性質，對其活性和功能的發揮具有重要意義。而肽段的C末端測序具有很高的實用價值。早期的基于羧肽酶法的C端測序通過檢測羧肽酶逐個釋放氨基酸的順序來判斷蛋白/肽段的C端序列，費時費力，難以實現應用。化學法指的是蛋白質/多肽與化學試劑反應后,專一性的裂解并檢測C端氨基酸的方法，由于標記試劑和裂解試劑的限制，導致產率低且靈敏度不高，一般只能測到C端5-6個氨基酸殘基。串聯質譜的發展為肽段C端從頭測序分析提供了強有利的工具。但是長序列(15個氨基酸以上)的肽段的在串聯質譜中無法獲得完整的碎片離子信息，導致質譜數據的后處理不能拼接出完整的序列信息。在肽段C端標記上堿性小分子后可以豐富二級質譜中y離子的數目，提高肽段在質譜中的響應和碎裂效率，獲得更多的碎片離子信息，有助于質譜從頭測序。在肽段C末端的標記方法中，中科院微生物所吳邊老師課題組發展的肽段C末端酰胺酶能夠特異性催化C末端的羧基發生酰胺化反應，這種特異性酶標記方法新穎，特異性高，可以有效避免肽段側鏈羧基發生反應(ACS Catal.2016,6,5405-5414)。因此，肽段C末端選擇性酶標記結合質譜技術的從頭測序方法具有廣闊應用前景。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于肽段C末端選擇性酶標記的質譜從頭測序方法。為實現該目的，本方法采用的技術方案為：

(1)將100-1000μg肽段(單條肽段或蛋白酶解后的多肽混合物)粉末溶解于純有機溶劑中：如，乙腈、丙酮、異丙醇、乙腈中加入0-5％的二甲亞砜、乙腈中加入0-5％的N,N-二甲基甲酰胺、丙酮中加入0-5％的二甲亞砜、丙酮中加入0-5％的N,N-二甲基甲酰胺、異丙醇中加入0-5％的二甲亞砜、異丙醇中加入0-5％的N,N-二甲基甲酰胺中的一種，有機溶劑的體積在100-1000μL。

(2)在肽段溶液中加入1-20μL帶有氨基的小分子，如：肼、乙二胺、丁二胺、戊二胺、環己二胺、三(2-氨基乙基)胺中的一種；或者丙烯胺、丙炔胺、2-丁烯胺、3-丁炔胺中的一種。

(3)將上一步得到肽段溶液轉移到特異性C末端酰胺酶中進行反應，時間為12-72h，酰胺酶的用量在50-500mg，反應溫度為25-50℃。

(4)第(3)步反應完畢后，針對直接標記的反應體系：離心5-30min后取上清凍干，用10-50μL的甲酸水溶液復溶，進行質譜鑒定。根據二級質譜中碎片離子的碎裂規律的特點，推導出肽段的序列。

(5)第(3)步反應完畢后，針對分步反應的反應體系可選擇路線一(針對上一步標記上的是丙炔胺、3-丁炔胺中的一種)：離心5-30min后取上清凍干，加入100-1000μL的1×PBS復溶。加入1-100μL母液為20mM的N,N-二甲基疊氮乙基胺或3-疊氮基丙胺使其終濃度為20-2000μM，加入1-50μL母液為2M的抗壞血酸鈉使其終濃度為2-100mM，加入1-50μL母液為100mM的三(3-羥基丙基三唑基甲基)胺使其終濃度為1-25mM，加入1-50μL母液為100mM的硫酸銅使其終濃度為100-5000μM，混合均勻后室溫震蕩30-180min。反應完畢進行除鹽凍干，用10-50μL的甲酸水溶液復溶，進行質譜鑒定。根據二級質譜中碎片離子的碎裂規律的特點，推導出肽段的序列。