[發(fā)明專利]產(chǎn)生IPS細(xì)胞的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711281188.1
• 申請(qǐng)日: 2009-08-11
• 公開（公告）號(hào): CN107988261A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A·梅克
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 細(xì)胞動(dòng)力國(guó)際有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N15/87;C12N5/10
• 代理公司: 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所11038
• 代理人: 羅菊華

本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)?00980138340.8的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

發(fā)明背景

本申請(qǐng)要求2008年8月12日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/088,054的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容無(wú)所放棄地通過(guò)引用方式特別并入本文。

1.發(fā)明領(lǐng)域

本申請(qǐng)大體上涉及干細(xì)胞領(lǐng)域。更具體而言，本申請(qǐng)涉及體細(xì)胞的重編程(reprogramming)。

2.相關(guān)技術(shù)描述

一般而言，干細(xì)胞是未分化的細(xì)胞，其可以產(chǎn)生成熟的功能性細(xì)胞的演替。例如，造血干細(xì)胞可以產(chǎn)生任意的不同類型的末端分化的血液細(xì)胞。胚胎干(ES)細(xì)胞源自胚胎，其是多潛能的，因此具有發(fā)育成任意器官或組織類型，或至少潛在地發(fā)育成完整胚胎的能力。

誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell)，通常簡(jiǎn)稱為iPS細(xì)胞或iPSC，是一類通過(guò)插入某些基因人工地從非多潛能細(xì)胞(通常為成年體細(xì)胞)衍生而來(lái)的多潛能干細(xì)胞。人們相信，在很多方面，誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞與天然多潛能干細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞是相同的，例如在以下方面：某些干細(xì)胞基因和蛋白的表達(dá)、染色質(zhì)甲基化的式樣、加倍時(shí)間、胚狀體(embryoid body)的形成、畸胎瘤的形成、活嵌合體的形成以及潛能和分化能力，但是其與天然多潛能干細(xì)胞的相關(guān)性的完整程度仍待確定。

IPS細(xì)胞首先于2006年從小鼠細(xì)胞中產(chǎn)生(Takahashi等人,2006)，于2007年從人類細(xì)胞中產(chǎn)生(Takahashi等人,2007；Yu等人,2007)。這在干細(xì)胞研究中被認(rèn)為是重要的進(jìn)展，因?yàn)檫@可以允許研究人員獲得多潛能干細(xì)胞而不必爭(zhēng)議性地使用胚胎，多潛能干細(xì)胞在研究中具有重要意義并且具有潛在的治療性應(yīng)用。

但是，在這些誘導(dǎo)的多潛能干(iPS)細(xì)胞的研究的現(xiàn)階段，產(chǎn)生iPS細(xì)胞的效率低下，這阻礙了iPS細(xì)胞在臨床研究中的應(yīng)用。因此，需要開發(fā)一種增強(qiáng)產(chǎn)生誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞的效率的方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明通過(guò)以改善的效率提供誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞而克服了本領(lǐng)域中的主要缺陷。在第一個(gè)實(shí)施方式中，提供了用于產(chǎn)生誘導(dǎo)的多潛能干(iPS)細(xì)胞群體的方法，所述方法包括以下步驟：(a)獲得一個(gè)或多個(gè)重編程載體，每個(gè)載體包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含：(i)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件；(ii)與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件可操作地連接的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼重編程因子或報(bào)告分子；(iii)位于所述第一核苷酸序列的3’端的IRES；和(iv)編碼重編程因子或報(bào)告分子的第二核苷酸序列，其位于所述IRES的3’端，從而所述第二核苷酸序列受到所述IRES的翻譯控制，其中：(1)，如果所述第一核酸編碼重編程因子，則所述第二核苷酸序列編碼另一重編程因子或報(bào)告分子；和(2)如果所述第一核酸編碼報(bào)告分子，則所述第二核苷酸序列編碼重編程因子；(b)將所述重編程載體導(dǎo)入體細(xì)胞群體的細(xì)胞中；(c)培養(yǎng)所述細(xì)胞以擴(kuò)展所述群體；(d)選擇所述經(jīng)擴(kuò)展的群體的子代細(xì)胞，其中所述子代具有胚胎干細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)特征；和(e)培養(yǎng)所選擇的子代細(xì)胞以提供iPS細(xì)胞群體。

在一些方面，所述第一核苷酸序列編碼重編程因子并且所述第二核苷酸序列編碼報(bào)告分子，反之亦可，因此報(bào)告基因的同時(shí)表達(dá)輔助如下文描述的重編程細(xì)胞的選擇。

為了在同一轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件下共表達(dá)多個(gè)重編程因子，表達(dá)盒可以包含第二IRES和位于第二IRES的3’端的第三核苷酸序列，從而所述第三核苷酸序列受到所述第二IRES的翻譯控制。在一些實(shí)施方式中，所述第一和第二核苷酸序列可以編碼不同的重編程因子。在以上任意情況下，報(bào)告分子可由第一、第二或第三核苷酸序列編碼以改善轉(zhuǎn)染和iPS細(xì)胞選擇效率。

本發(fā)明的能力部分依賴于報(bào)告分子的表達(dá)，例如熒光蛋白，其作為感染效率的指示，一般與來(lái)自同一多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄本的重編程基因的表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)，一旦細(xì)胞被完全誘導(dǎo)為多潛能，則所述報(bào)告分子即沉默。例如，上述方法的步驟c)可以進(jìn)一步包括選擇體細(xì)胞的群體，其中所述體細(xì)胞表達(dá)報(bào)告分子，并且培養(yǎng)所選細(xì)胞以擴(kuò)展該群體。因此，在一些方面，可以使用熒光輔助的細(xì)胞分選法(FACs)基于報(bào)告分子例如熒光蛋白的表達(dá)水平來(lái)選擇被感染(從最低效率感染至最高效率感染)的細(xì)胞。