[發明專利]一種煙曲霉唑類耐藥的分子生物學快速檢測方法

在審

• 申請號: 201711276495.0
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN109880892A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 劉沐桑;劉維達;鄭海林;梁官釗
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院皮膚病醫院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 南京天翼專利代理有限責任公司 32112
• 代理人: 李建芳

本發明公開了一種煙曲霉唑類耐藥的分子生物學快速檢測方法，采集臨床標本，用真菌微量DNA提取試劑盒提取真菌DNA，使用真菌ITS特異引文進行擴增，將擴增結果進行測序，blast確定標本中真菌種類，如果有煙曲霉，優化TaqMan探針，使用realtime PCR技術檢測L98H突變型對應的核酸位點DNA第363?365bp有無突變。本發明煙曲霉唑類耐藥的分子生物學快速檢測方法，具有耗時短，敏感性好，準確性高等優勢。

技術領域

本發明涉及一種煙曲霉唑類耐藥的分子生物學快速檢測方法，屬于耐藥監測領域。

背景技術

曲霉是最常見的環境真菌，多感染免疫缺陷人群引起肺、鼻竇和腦曲霉病，治療困難且病死率高。一項北美對960例侵襲性曲霉病的研究發現，主要為血液腫瘤、器官移植和造血干細胞移植患者并發肺部感染，12周內病死率高達45.6％。我國的數據提示侵襲性曲霉病在血液干細胞移植患者發病率10.8％而病死率60％，肝移植患者發病率4.8％而病死率62.5％，并且侵襲性曲霉病的發病率在逐年增加。

侵襲曲霉病絕大多數由煙曲霉引起，在歐洲達到95％以上。自1997年美國報道了首例伊曲康唑耐藥以來，煙曲霉耐藥逐漸增加，中國孫毅等也陸續報道了煙曲霉伊曲康唑耐藥和聯合耐藥。英國研究發現煙曲霉唑類耐藥比率1997-1998年為0％，2004-2005年為5％，2007年為17％，2008年為14％，2009年為20％，其中2008-2009年78％耐藥株為多重耐藥。

唑類藥物使真菌病治療有了革命性的突破，不僅僅因為抗菌譜廣，還因為相對于兩性霉素B藥物毒性明顯降低。2008年美國感染性疾病協會發表的曲霉病治療方案中，肺、鼻竇和腦等侵襲性曲霉病首選伏立康唑，其次為兩性霉素B及其脂質體、卡泊芬凈、泊沙康唑和伊曲康唑。伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑可口服，故慢性或過敏性曲霉病首選。因此，煙曲霉唑類耐藥的臨床危害很大，且有逐漸增加的趨勢，需要密切關注和積極研究。

國內外的真菌耐藥檢測還是以傳統真菌培養和藥敏實驗為主，耗時長，敏感性差。

發明內容

為了解決現有技術中存在的上述缺陷，本發明提供一種煙曲霉唑類耐藥的分子生物學快速檢測方法。

為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種煙曲霉唑類耐藥的分子生物學快速檢測方法，采集臨床標本，用真菌微量DNA提取試劑盒提取真菌DNA，使用真菌ITS特異引文進行擴增，將擴增結果進行測序，blast確定標本中真菌種類，如果有煙曲霉，優化TaqMan探針，使用realtime PCR技術檢測L98H突變型對應的核酸位點DNA第363-365bp有無突變。

為了提高檢測準確性，優選，步驟1)中，真菌微量DNA提取試劑盒為Qiagen真菌微量DNA提取試劑盒。

設計特異性引物，對我國臨床最為常見的煙曲霉唑類耐藥突變TR34/L98H和

TR34/L98H/S297T/F495I進行快速的分子生物學檢測。由于我國cyp51A基因突變尤其以L98H型突變最為常見，該突變導致高度的伊曲康唑MIC＞16mg/L)、伏立康唑和泊沙康唑耐藥。L98H突變型對應的核酸位點為DNA第363-365bp，是一個SNIP位點，可以有2種以上的基因型。

本發明未提及的技術均參照現有技術。

本發明煙曲霉唑類耐藥的分子生物學快速檢測方法，具有耗時短，敏感性好，準確性高等優勢。

附圖說明

圖1為現有技術及本申請檢測方法對照示意圖。

具體實施方式

為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限于下面的實施例。