[發明專利]一種基于代謝組學技術的有機污染物低劑量聯合暴露毒性效應評估方法

在審

• 申請號: 201711275619.3
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN109880877A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 王菲迪;陳吉平;張海軍;耿檸波;張保琴;任曉倩
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N27/62
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種有機污染物低劑量聯合暴露毒性效應評估方法，其特征在于：

包括以下步驟：

(a)兩種有機污染物對細胞分別進行單獨暴露以及二者聯合暴露；

(b)利用擬靶向代謝組分析方法得到無偏見且精確的代謝物信息；

(c)多重比較分析和代謝通路分析步驟b中所得代謝物信息，找出含量顯著變化(P<0.05，且FDR<0.05)的代謝產物及受干擾的代謝通路；

(d)通過計算代謝影響水平指數來定量描述聯合暴露對整體代謝和專一代謝通路的聯合暴露效應類型；

(e)進一步對代謝路徑限速酶活性的測定，確認代謝通路的變化方向以及混合物中主要風險驅動化合物。

2.根據權利要求1所述的評估方法，其特征在于：步驟a中，HepG2細胞在37℃，含有5％CO₂的細胞培養箱中培養，培養基為含10％FBS和1％青霉素-鏈霉素的DMEM細胞培養液；取對數期生長的細胞接種至6孔板用于胞內小分子代謝物的代謝組學分析和相關酶活性測試，接種密度為3×10⁵細胞/孔，待細胞鋪滿6孔板的80％后進行污染物的單獨以及聯合暴露試驗，暴露時間為24h；污染物通過溶解在DMSO中引入細胞培養液，暴露濃度選擇的是有機污染物在環境或人體中存在濃度的中間值，單獨暴露時兩種污染物在培養液中的最終濃度與聯合暴露時相同；DMSO在培養液中的最終濃度為0.05％(v/v)，對照組中只含有0.05％的DMSO。

3.根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于：步驟b中，擬靶向代謝組分析方法對細胞代謝產物進行分析，得到無偏見且精確的代謝物信息；首先采用高分辨Q-TOF MS的AutoMS/MS功能對分子量在50–1000的代謝物進行全掃和二級質譜掃描；采集到的原始數據使用MassHunter Quantitative Analysis軟件按AutoMS/MS查找化合物，保留時間窗口設置為0.15min，質量匹配容差設置為0.05m/z，將參比離子質量排除，獲得母離子，子離子，保留時間和碰撞能等信息列表；根據這些化合物的精確質量數和二級質譜圖在METLIN代謝組學數據庫(http://metlin.scripps.edu/)進行檢索，從而對這些化合物進行鑒定，并搜索KEGG數據庫(http://www.genome.jp/kegg/)進行進一步的確認，鑒定不到的化合物暫時用編號代替，同時其中部分化合物還通過標準品進行了準確鑒定；然后采用高靈敏度的Q-Trap MS對Q-TOF MS所獲得的離子對進行Schedule MRM分析，進行準確地定量。

4.根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于：步驟c中統計學分析基于在線的http://www.metaboanalyst.ca./對Q-Trap MS分析所得數據進行處理，找出污染物暴露后細胞內含量顯著變化的代謝物；通過在線數據庫(KEGG,http://www.genome.jp/kegg/)查明顯著變化代謝物參與的代謝通路，將參與相同代謝通路，且顯著相關(皮爾森相關系數∣Cij∣>0.6，且P<0.05)的代謝物相連，并且將代謝物在單獨暴露以及聯合暴露組中的變化用不同顏色和粗細的直線表現出來，從而構建出代謝物的相關網絡圖；用IncroMap軟件對有HMDB(www.hmdb.ca/)ID的差異代謝物進行代謝通路富集分析，通過對差異代謝物的倍數變化(FC)數據建立t-test和Q-statistic模型進行分析，基于KEGG通路數據庫找出受顯著影響的代謝通路。