[發明專利]一種純化尿促卵泡素粗品的方法

在審

• 申請號: 201711274951.8
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN109879953A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 劉乃山;夏襯來;尚明彩
• 申請（專利權）人: 青島康原藥業有限公司
• 主分類號: C07K14/59
• 分類號: C07K14/59;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種從取尿促卵泡素粗品提純尿促泡素的方法，其特征在于：

（1）粗制品經過協和樹脂吸附、洗脫、柱分離得協和粗制品；

（2）協和粗制品在按比例加入DEAE Cellullose進行溶解上樣、洗滌、洗脫；

（3）洗脫液加入冷乙醇，進行沉淀，沉淀物經過離心、五氧化二磷干燥得DEAECellullose層析中間體；

（4）Cellullose層析中間體按比例加入磷酸鹽緩沖液進行溶解經過HP樹脂柱上樣、洗滌、洗脫；洗脫液經過超濾、沉淀、離心、干燥得HP柱分離干品。

2.根據權利要求1步驟（1）中所述按粗制品重量1:7.5（w/v）加入緩沖液，在8-12℃條件下攪拌溶解，用轉速3500rpm冷凍離心機離心取上清液，加入pH=5.3~5.4的醋酸鈉緩沖溶液，溶液體積為干粉重量的100（v/w）倍，用冰乙酸調節pH5.3-5.4，上樣流速控制在15-18L/h，棄去穿透液，對樹脂柱進行洗滌，流速控制在15-18L/h，棄去穿透液，用洗脫液對樹脂柱進行洗脫，流速控制在18-25L/h以上，收集洗脫液（280nm OD值≥1.0時開始收集，≤1.0停止收集），將洗脫液加90%以上的乙醇進行沉淀，沉淀至80±1度，溫度保持在10℃以下，沉淀36-40h，虹吸上層乙醇，下層沉淀物用轉速3500rpm冷凍離心機離心，收集沉淀物用無水乙醇脫水，按固體物重量1:5（w/v）比例加入無水乙醇脫水、離心，收集離心固體物，固體物用五氧化二磷真空干燥得協和中間體。

3.根據權利要求1步驟（1）中所述洗脫液的制備方法，0.421份95%乙醇加0.579份水，攪拌均勻，配成40%乙醇，后將乙酸銨溶入40%乙醇中，使每升溶液中乙酸銨含量為100克。

4.根據權利要求1步驟（2）中所述在8-10℃條件下，按協和干粉重量1:100（w/v）加0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.5）中攪拌溶解；按20-24L/h流速進行上樣，上樣結束后，用0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.5）洗滌至流出液280nm處OD值在0.25以下，流速控制在24-27L/h左右，用0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.5）洗脫，流速控制在27-30L/h左右，洗脫至流出液280nm處OD值在0.35以上，滴加乙醇變渾濁后，開始收集流出液，直到280nm處OD值在0.35以下，停止收集流出液，洗脫結束后，用再生液1洗滌2個柱體積，用純化水洗滌5個柱體積，再用再生液2洗滌2個柱體積，最后用純化水洗滌5個柱體積，流速均控制為27-30L/h。

5.根據權利要求4步驟中所述再生液1（0.5mol/L鹽酸溶液）：取41. 7ml鹽酸，加純化水至1000ml搖勻，即得，再生液2（0.5mol/L氫氧化鈉溶液）：取20g氫氧化鈉，加純化水溶解，稀釋至1L混勻，即得， 0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.5）：稱取三羥甲基氨基甲烷6.1g，加純化水溶解，用HCl調pH7.5，并稀釋至1L，即得， 0.2 mol/L Tris-HCl洗脫液（pH7.5）：稱取三羥甲基氨基甲烷24.2g，加純化水溶解，用HCl調pH7.5，并稀釋至1L，即得。

6.根據權利要求1步驟（3）中所述計量流出收集液體積，加入5倍量（v/v）95%冷乙醇（≤-5℃），攪拌均勻，然后靜置沉淀沉淀15-18h，離心、脫水：虹吸去上清液，下層沉淀物置入轉速3500rpm冷凍離心機中離心，棄去上清液。

7.用無水乙醇脫水，離心，得沉淀物與離心杯一起置用五氧化二磷做干燥劑的真空干燥箱內室溫真空（-0.1Mpa）干燥，干燥后得DEAE Cellullose層析中間品。

8.根據權利要求1步驟（4）中所述用緩沖液A平衡柱體，控制流速為1L/min，時間為1小時，取樣品，按每升緩沖液A溶解10g產品，量取緩沖液A，上樣：在≤15℃，將樣品溶解液，按1L/min的流速進行上樣，洗滌：上樣結束后，用緩沖液A沖洗柱體，流速控制為1L/min；洗滌至流出液OD值在0.25以下，洗脫：用緩沖液B進行洗脫，流速控制在1L/min左右，洗脫至流出液OD值在0.35以上，加乙醇變渾濁后，開始收集流出液，直到OD值在0.35以下，停止收集流出液，柱再生：洗脫結束后，用0.5mol/L氫氧化鈉按柱體積的1：2洗滌2個柱體積，再用同樣比例的20%乙醇洗滌5個柱體積，流速均控制位1L/min，待用，超濾：計量洗脫液體積，按1:2的比例加超濾液C，在15℃以下條件，用Cut-off 10KD的超濾膜超濾，超濾液體積為原體積的15-20%，沉淀：計量超濾液體積，轉入不銹鋼桶內，加入5倍量（V/V）的-20℃的95%乙醇，用攪拌棒攪拌均勻，靜置沉淀12-16小時；

離心、脫水：虹吸棄去桶內的上層廢乙醇，下層沉物置入轉速3700r/h冷凍離心機中離心，溫度4℃，離心30分鐘，棄去上清液，用無水乙醇脫水離心，棄去上清液得沉淀物，與離心罐一起置于用五氧化二磷做干燥劑的真空干燥箱內干燥，干燥后得收率在9‰以上尿促卵泡素。