[發明專利]分離土壤中大麗輪枝菌的方法

在審

• 申請號: 201711273106.9
• 申請日: 2017-12-06
• 公開（公告）號: CN108018214A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: 魏鋒;崔麗芳;朱荷琴;馮自力;馮鴻杰;師勇強;趙麗紅;周京龍;袁媛
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

本發明涉及微生物的分離，具體涉及分離土壤中大麗輪枝菌的方法。所述方法包括步驟：土壤樣品預處理；制備選擇性培養基；土壤樣品水篩處理；土壤樣品蔗糖密度梯度離心；涂布、培養；單孢純化；培養上述菌落。本發明的分離土壤中大麗輪枝菌的方法步驟簡單易操作，分離效率較高。

技術領域

本發明涉及微生物的分離，具體涉及分離土壤中大麗輪枝菌的方法。

背景技術

大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的植物黃萎病為單循環病害，初侵染來源于土壤及植株殘體中的微菌核。大麗輪枝菌是典型的土傳病原真菌，可以侵染400多種植物。

對土壤中大麗輪枝菌的檢測和分離純化是進行病原菌遺傳多樣性和病害防治研究的基礎。大麗輪枝菌種群內具有非常豐富的遺傳多樣性，在大田中，經常發現相同棉花品種在同一塊棉田中發病棉株表現不同的癥狀類型(即癥狀多樣性)，并且棉株的受害程度也表現各異。造成這種現象的原因可能有微菌核在土壤中的分布不均勻、棉花植株個體間抗病性差異或者土壤中棉花黃萎病菌的致病力變異。但是迄今為止，關于土壤中大麗輪枝菌的群體遺傳變異尚缺乏研究。其主要原因是現有土壤中大麗輪枝菌的分離純化技術耗時長、污染率高。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何快速、高效地分離純化土壤中大麗輪枝菌。

根據本發明的分離土壤中大麗輪枝菌的方法，包括以下步驟：

(1)土壤樣品預處理，土壤樣品風干以殺死菌絲和孢子，使含水量在10％左右，研磨后過篩去除大顆粒，收集通過篩孔的土樣；

(2)制備選擇性培養基，選擇性培養基配方為，2g硝酸鈉，1g磷酸二氫鉀，0.5g七水硫酸鎂，0.5g氯化鉀，0.01g七水合硫酸亞鐵，2g多聚半乳糖醛酸，1mL tergitol NP10，15g瓊脂，用水定容至1L，調節pH值至6.4，滅菌后冷卻，添加10％體積的抗生素混合液，每10mL抗生素混合液含有6mg鏈霉素，6mg氯霉素，6mg金霉素和0.6mg維生素H；

(3)土壤樣品水篩處理，將待測土樣充分混勻，土樣以無菌水定容，震蕩，在水流下將土壤懸液過兩層篩網，上層用70目，下層500目，將500目篩網上面的殘留物用無菌水沖洗，收集、定容至，離心棄上清；

(4)土壤樣品蔗糖密度梯度離心，將收集的土壤顆粒進行蔗糖密度梯度離心，將上清液中加入無菌水，用微孔濾膜進行過濾；

(5)涂布、培養，過濾后，以無菌水清洗微孔濾膜，收集洗滌液，并涂布在選擇性培養基的平板上，將涂布后的平板放置在25℃的恒溫培養箱中培養，培養3～4d，挑取菌落形態類似大麗輪枝菌，且菌落中央含有黑色微菌核的單個無污染的菌落，轉移到PDA培養基上培養；

(6)單孢純化，從上述菌落邊緣部分挑取帶有菌絲的培養基，制成孢子懸浮液，濃度為300～400個孢子/mL，將孢子懸浮液均勻涂布于水瓊脂平板上，置25℃條件下暗培養30小時，觀察孢子萌發的情況，標記單個萌發的孢子，挑取帶有單菌落的餅塊到PDA平板上，于25℃黑暗培養；

(7)培養上述菌落，觀察菌落形態，顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態，并結合分子檢測，鑒定大麗輪枝菌。

根據本發明的分離土壤中大麗輪枝菌的方法，在步驟(2)中，高壓滅菌后，待培養基冷卻到55℃，添加抗生素混合液。

根據本發明的分離土壤中大麗輪枝菌的方法，在步驟(3)中，土樣以無菌水定容，用往復式搖床在室溫175rpm轉速下震蕩1h，在水流下將土壤懸液過兩層篩網，上層用70目，下層500目，將500目篩網上面的殘留物用無菌水沖洗，收集、定容至20mL，1600×g離心5min，棄上清。