[發明專利]一種雙分子熒光互補技術用于免疫診斷檢測的方法

在審

• 申請號: 201711271868.5
• 申請日: 2017-11-27
• 公開（公告）號: CN108226517A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 徐林
• 申請（專利權）人: 南京天縱易康生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種雙分子熒光互補技術用于免疫診斷檢測的方法，包括：兩個互補的熒光蛋白片段、蛋白與抗體的連接肽、抗體和抗原待測物，首先將熒光蛋白按特定位點切開形成不發熒光的兩個片段，通過基因重組技術，表達純化含有連接序列的兩個熒光蛋白片段，熒光蛋白N端片段與一抗體通過偶聯劑相連，熒光蛋白C端片段與另一抗體通過偶聯劑相連，在待測物存在情況下，兩個抗體和待測物形成三元復合物，同時熒光蛋白N端片段和熒光蛋白C端片段靠近、互補，并重新形成有活性的熒光蛋白，通過檢測熒光強度的變化，可判斷目標待測物的量。此方法適用于抗體與抗原反應的免疫檢測，可同時檢測多種待測物，及時診斷多種疾病，在體外免疫診斷中具有巨大前景。

技術領域

本發明涉及一種雙分子熒光互補技術用于體外免疫診斷檢測的方法，屬于疾病診斷檢測領域。

背景技術

雙分子熒光互補技術是一種以熒光蛋白為材料的片段互補系統。其基本原理是將熒光蛋白在合適的位點切開，成形成不發熒光的兩個片段，這兩個片段不能自發地組裝成完整的熒光蛋白，在該熒光蛋白的激發光激發時不能產生熒光，但當這兩個熒光片段分別連接到一組有相互作用的目標蛋白上，由于目標蛋白的相互作用，熒光蛋白的兩個片段在空間上互相靠近互補，重新構建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，并在該熒光蛋白的激發光波長激發下，發射熒光。雙分子熒光互補技術能夠特異性的檢測到蛋白的相互作用，是一種檢測蛋白相互作用的簡便、直觀、靈敏的方法。

本發明提出的基于雙分子熒光互補技術的免疫診斷檢測方法是首先將熒光蛋白按特定位點切開形成不發熒光的兩個片段，通過基因重組技術，表達純化含有連接序列的兩個熒光蛋白片段，得到的含有連接序列的熒光蛋白N端片段與一抗體通過偶聯劑相連，含有連接序列的熒光蛋白C端片段與另一抗體通過偶聯劑相連，在待測物存在情況下，兩個抗體和待測物形成三元復合物，同時熒光蛋白N端片段和熒光蛋白C端片段靠近、互補，并重新形成具有活性的熒光蛋白，熒光蛋白活性由熒光強度所體現，待測物的含量與形成的熒光蛋白強度呈正相關。通過檢測待測物的熒光強度，然后再通過標準曲線把信號轉換成待測物的濃度，可判斷目標待測物的量。此種技術方法適用于所有技術平臺的抗體與抗原反應的免疫檢測，不同的雙分子熒光之間的光譜差異可用于同時檢測多種待測物，及時診斷多種疾病，在體外免疫診斷中具有巨大應用前景。

目前，針對熒光免疫檢測的方法，需要對抗原抗體反應液進行清洗，洗去未結合抗原的熒光標記抗體，由于清洗會造成試劑的精密度下降，而基于雙分子熒光互補技術的免疫檢測方法不需要對反應完成后的反應液進行清洗，從而能大大提高試劑的精密度和準確度。

在此之前，雙分子熒光互補技術主要用于細胞內蛋白質之間的相互作用，用于免疫診斷的檢測幾乎空白，本發明首次提出了一種雙分子熒光互補技術用于體外免疫診斷檢測的方法，可快速、簡便、準確地診斷相關疾病。

發明內容

針對現有技術中存在的技術問題，本發明提供一種雙分子熒光互補技術用于體外免疫診斷檢測的方法。

本發明所提供的免疫檢測待測抗原的方法，具體可包括如下步驟：

(1)將熒光蛋白分成N端部分和C端部分：在所述N端部分的編碼基因的5’或3’末端加上連接序列基因，形成含有連接序列的熒光蛋白N端片段；在所述C端部分的編碼基因的5’或3’末端加上連接序列基因，形成含有連接序列的熒光蛋白C端片段；

其中，所述連接序列的加入是為了使熒光蛋白能夠充分折疊。

(2)將所述含有連接序列的熒光蛋白N端和C端基因序列導入表達宿主，誘導表達純化得到目的蛋白。

(3)將所述含有連接序列的熒光蛋白N端和C端通過戊二醛一步法或兩步法、或EDC/NHS法、或過碘酸鈉氧化法分別偶聯到抗體上。