[發(fā)明專利]一種定量測定天麻中總天麻苷元含量的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711271651.4
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108020615A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐春蘭;吳冰楚;張正
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/74;G01N30/86
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種定量測定天麻中總天麻苷元含量的方法，包括如下步驟：1)提取：將各天麻樣品編號并磨成粉末，選其中一份并從中稱取0.5g樣品，加于置有10mL 50％甲醇-水溶液的試管中，用玻璃棒將混合物攪拌混勻，進(jìn)行超聲處理并持續(xù)30min；然后再次用玻璃棒攪拌混勻，繼續(xù)進(jìn)行超聲處理并持續(xù)30min；將所得混合物液體倒入10ml的EP管中，進(jìn)行離心處理，保持3000rpm的速度處理10min，取離心處理后混合液的上清液，將所取上清液經(jīng)0.22μm的微孔濾膜進(jìn)行濾過處理，得濾液提取物；2)堿水解：取步驟1)中所得提取物50μL，與50μLNaOH溶液混合，所述NaOH溶液的濃度為0.5-3mol/L,該混合溶液制作3份，并將其分別于60-80℃環(huán)境溫度進(jìn)行水解0.5-2h，其后再用HCl溶液將每份混合溶液分別滴定至中性，所述HCl溶液濃度為0.5-3mol/L；3)酶水解：取步驟2)中堿水解后所得的3份樣品，分別加入500μL 4mg/mL酶溶液，用緩沖液定容至1mL，將混合液進(jìn)行水解處理，保持轉(zhuǎn)速400-1000rpm并保持50℃環(huán)境溫度持續(xù)震蕩1-3h，將提取物中的總天麻素水解成天麻苷元；然后將離心處理所得水解后混合液放入85℃水浴鍋放置4min進(jìn)行滅活處理，冷卻，每份樣品加入3mL冰冷的純甲醇，將即得混合液離心處理，4℃環(huán)境溫度中保持轉(zhuǎn)速12000rpm離心處理10min，經(jīng)0.22μm的微孔濾膜進(jìn)行濾過處理；從每份樣品所得濾液中取400μL上清液,分別加入600μL50％甲醇-水溶液中混勻，分析測定得天麻提取物中總天麻苷元含量；4)高效液相色譜-熒光檢測(HPLC-FLD)方法處理：對應(yīng)樣品分別進(jìn)行處理，色譜柱為島津InertSustain C18，色譜柱的長度、內(nèi)徑、粒徑分別為150mm、4.6mm、5μm，柱溫為30℃，流動相為純甲醇和0.5％的甲酸水溶液，梯度洗脫程序：保留時(shí)間間隔段0-5min，0.5％的甲酸水溶液體積比5％-40％，即在參數(shù)段甲酸水溶液體積比由5％漸升至40％；保留時(shí)間間隔段5-15min，維持體積比40％的0.5％的甲酸水溶液；過程流速保持為1mL/min；熒光激發(fā)波長為275nm,發(fā)射波長為295nm；程序進(jìn)樣量為2μL；5)分析：以HPLC-FLD為手段對待測供試品溶液成分進(jìn)行定性和定量分析：通過對一系列不同質(zhì)量濃度的天麻苷元對照標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行分析，獲得對照標(biāo)準(zhǔn)品溶液中天麻苷元的保留時(shí)間和峰面積，通過對待測供試品溶液的分析，獲得待測天麻提取物堿-酶水解后天麻苷元的保留時(shí)間和峰面積；6)實(shí)例測定：外標(biāo)法測定天麻中總天麻苷元的含量；7)繪制圖表：通過對一系列不同質(zhì)量濃度的天麻苷元的對照標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行分析，以天麻苷元的已知質(zhì)量濃度和對應(yīng)的峰面積作為橫縱坐標(biāo)，建立天麻苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測天麻提取物中總天麻苷元的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，對其進(jìn)行定量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定天麻中總天麻苷元含量的方法，其特征在于：所述步驟2)中，所述NaOH溶液的濃度為0.5mol/L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定天麻中總天麻苷元含量的方法，其特征在于：所述步驟2)中，所述水解參數(shù)中環(huán)境溫度為80℃。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定天麻中總天麻苷元含量的方法，其特征在于：所述步驟2)中，水解時(shí)間為0.5h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定天麻中總天麻苷元含量的方法，其特征在于：所述步驟2)中，所述HCl溶液濃度為0.5mol/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定天麻中總天麻苷元含量的方法，其特征在于：所述步驟3)中的酶溶液包括β-葡萄糖苷酶，酶活力100000U/g。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定天麻中總天麻苷元含量的方法，其特征在于：所述步驟3)中，水解處理時(shí)轉(zhuǎn)速為1000rpm，震蕩時(shí)間為3h。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定天麻中總天麻苷元含量的方法，其特征在于：所述步驟3)中，所述冰冷的純甲醇，冰冷溫度值為4℃。