[發(fā)明專利]一種基于原子力顯微鏡的紅細(xì)胞力學(xué)特征的檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711270542.0
• 申請(qǐng)日: 2017-12-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108037320A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賀銘;張杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): G01Q60/24
• 分類號(hào): G01Q60/24;G01N33/556
• 代理公司: 北京權(quán)智天下知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11638
• 代理人: 劉玉欣

本發(fā)明提供了一種基于原子力顯微鏡的紅細(xì)胞力學(xué)特征的檢測(cè)方法，涉及生物物理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是使用細(xì)胞爬片固定紅細(xì)胞，具體步驟為：紅細(xì)胞懸液制備、細(xì)胞爬片預(yù)處理、原子力顯微鏡樣品制備、使用原子力顯微鏡在液態(tài)環(huán)境下檢測(cè)紅細(xì)胞力學(xué)特征。用細(xì)胞爬片固定紅細(xì)胞，可保持紅細(xì)胞仍然處于生理狀態(tài)，對(duì)紅細(xì)胞的正常形態(tài)和功能的維持作用是非常明顯的。常規(guī)使用的細(xì)胞爬片經(jīng)過(guò)必要的消毒和無(wú)害化處理，對(duì)紅細(xì)胞沒(méi)有附加的藥物影響和毒害，不會(huì)影響細(xì)胞的形態(tài)和功能。經(jīng)過(guò)細(xì)胞爬片處理的紅細(xì)胞，既能保證紅細(xì)胞穩(wěn)定地附著住，又能單一檢測(cè)出紅細(xì)胞的力學(xué)特征而不會(huì)有其他影響和干擾，能夠反映細(xì)胞真實(shí)的生理特征。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物物理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紅細(xì)胞力學(xué)特征的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

上世紀(jì)八十年代出現(xiàn)的原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope,AFM)可以在液體環(huán)境下，以極高的靈敏度和分辨率對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行表面形貌成像及力學(xué)性質(zhì)檢測(cè)，細(xì)胞的力學(xué)特性包括彈性、黏度和硬度等。通過(guò)細(xì)胞彈性，硬度的改變，可推知細(xì)胞在生理病理過(guò)程中的變化。生物細(xì)胞力學(xué)的研究與諸多生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)，機(jī)體的器官、組織、細(xì)胞和生物大分子在一定范圍力學(xué)作用下發(fā)生相應(yīng)的形態(tài)和功能改變，這是機(jī)體對(duì)力學(xué)刺激的響應(yīng)過(guò)程，而機(jī)體對(duì)一定范圍力學(xué)刺激的自適應(yīng)，對(duì)于維持正常生理功能具有重要作用。原子力顯微鏡有一個(gè)重要的特點(diǎn)，即利用其非修飾和修飾探針進(jìn)行樣品掃描，可以得到樣品表面形貌，并獲得樣品表面某一特定點(diǎn)的力與距離的關(guān)系曲線，進(jìn)而得到黏附力、鍵合力等數(shù)據(jù)以及樣品的機(jī)械性質(zhì)。

原子力顯微鏡的優(yōu)缺點(diǎn)：與傳統(tǒng)顯微技術(shù)相比，AFM具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.可達(dá)到原子級(jí)高分辨率。無(wú)論是橫向還是縱向的高分辨率都可以在普通的商用機(jī)上獲得。2.可得到高分辨的物體表面三維形貌，獲得樣品表面形貌、彈性、粘性、力學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)等多種信息。3.可以在多種環(huán)境(如真空、氣體、溶液、電化學(xué)環(huán)境等)下工作，能在接近生理狀態(tài)的條件下觀察樣品，從而避免制樣過(guò)程中所造成的樣品變形或變性。4.無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行包埋、覆蓋、染色，制樣簡(jiǎn)單，對(duì)樣品無(wú)侵入性、破壞性，可以探測(cè)柔軟的樣品表面的結(jié)構(gòu)信息。5.樣品可以是金屬、半金屬、半導(dǎo)體及絕緣體，基底可以是云母、玻璃片、硅片、高取向熱解石墨、金等。6.AFM通過(guò)調(diào)節(jié)成像操作力的大小，選擇合適的成像模式，不易引起樣品漂移、損壞，圖像可重復(fù)性高。AFM在生命科學(xué)研究中盡管有著極大的優(yōu)越性，但同時(shí)也存在以下缺點(diǎn)：1.針尖的曲率半徑及形狀對(duì)圖像的影響。只有針尖比掃描對(duì)象更尖銳，才能將掃描對(duì)象的邊界真實(shí)呈現(xiàn)出來(lái)；當(dāng)掃描對(duì)象比針尖更尖銳時(shí)，圖像將會(huì)發(fā)生失真。2.不可獲得樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。AFM能夠獲取比其它顯微技術(shù)更多的表面信息，但無(wú)法像透射電鏡(TransmissionElectron Microscopic，TEM)或近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡那樣觀察細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。3.對(duì)掃描樣品的識(shí)別問(wèn)題。AFM只能得到樣品表面的形貌圖，卻不能識(shí)別樣品表面的物質(zhì)，所以AFM適合掃描單一的物質(zhì)，對(duì)于混合物AFM很難直接從形貌上把它們區(qū)分開(kāi)來(lái)。4.掃描速率的問(wèn)題。目前商用AFM得到一幅高分辨的圖像需要幾分鐘到數(shù)十分鐘。很多生化反應(yīng)是瞬時(shí)完成的，還不能用AFM觀測(cè)。5.由于施加給AFM懸臂的力的精確度受到外部因素如熱漂移等的影響，只能人為地通過(guò)平滑等將這種漂移抵消。

針對(duì)正常人成熟紅細(xì)胞而言，使用原子力顯微鏡技術(shù)檢測(cè)其生理狀態(tài)下的力學(xué)特征，目前的技術(shù)常常會(huì)帶來(lái)許多問(wèn)題和對(duì)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響，不能反映紅細(xì)胞真實(shí)的、生理狀態(tài)下的力學(xué)指標(biāo)。例如，常規(guī)方法為使用1％戊二醛固定法固定紅細(xì)胞，需要對(duì)固定樣品進(jìn)行干燥，在氣態(tài)條件下對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行原子力顯微鏡檢測(cè)力學(xué)特征。這樣的處理方式帶來(lái)了對(duì)紅細(xì)胞最重要的影響是：干燥處理使原本處于生理狀態(tài)下的紅細(xì)胞失去了正常的生物學(xué)特征、性狀和功能，以此條件檢測(cè)得出的結(jié)果，不能反映真實(shí)的紅細(xì)胞形態(tài)和功能。其次，戊二醛作為一種化學(xué)物質(zhì)，無(wú)論使用多小的劑量，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特征或功能或多或少都會(huì)有影響，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響也是不可回避的。最后，戊二醛固定的處理方法，可使待檢測(cè)的樣品表面的粘滯度增大，造成原子力顯微鏡探針受到粘滯力作用而無(wú)法正常工作。

發(fā)明內(nèi)容