[發明專利]全基因組互作文庫及其構建方法

有效

• 申請號: 201711268729.7
• 申請日: 2017-12-05
• 公開（公告）號: CN108265049B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 王克劍;王春;劉慶;任俊
• 申請（專利權）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 韓建偉;謝湘寧

本發明提供了一種全基因組互作文庫及其構建方法。該構建方法包括：步驟S1，利用引物序列將DNA?蛋白交聯復合物經酶切產生的末端進行連接，形成環狀復合物；步驟S2，將環狀復合物進行解交聯，得到環狀DNA；以及步驟S3，將環狀DNA進行片段化文庫構建，得到全基因組互作文庫。該方法用一段外源的已知DNA序列對酶切產物片段末端進行連接，使DNA?蛋白交聯復合物形成環狀復合物，然后再經過接交聯將環狀復合物中的蛋白去除，從而獲得環狀DNA，利用該環狀DNA中所攜帶的外源已知DNA序列進行片段化文庫構建，即可獲得用于全基因組互作研究的全基因組互作文庫，提供了一種簡便的、操作性廣的研究全基因組互作的方法。

技術領域

本發明涉及高通量測序文庫構建領域，具體而言，涉及一種全基因組互作文庫及其構建方法。

背景技術

早期對基因表達調控的研究大都是建立在DNA鏈是一條線性鏈基礎上的，即認為啟動子、外顯子、內含子、增強子、絕緣子等以線性形式分布于DNA鏈上。實際上，真核DNA是以高度折疊濃縮成染色質的方式存儲于細胞核內。染色質在空間上具有高級結構和構象；而且這種高級結構和構象在基因轉錄、調控的過程中扮演著非常重要的角色。因此，要徹底解析基因的轉錄、DNA復制、DNA的修復等過程，必然要求了解染色質的空間組織形式，比如基因組在空間的分布以及相互接觸和聚集方式、調控元件的分布、染色質的結構動態等，這將使我們對生命這一最復雜的行為得到進一步的認識。

目前，已經有很多分子實驗技術被用來研究染色質的三維空間結構以及相互作用，如熒光標記的原位雜交技術(fluorescence insitu hybridization，FISH)可以用來研究細胞內染色質的三維結構(Yokotaetal.，1995)，但是其分辨率有限以及不能很好地研究基因組大范圍的離散基因位點相互作用情況。

染色質構象捕獲(chromosome conformation capture，3C)技術原本用于研究酵母基因表達時的染色質的空間構象(Dekkeretal.，2002)，后來也被用于研究高等哺乳動物染色質間的相互作用(Skoketal.，2007)。染色質構象捕獲(3C)的原理是：如圖1所示，(1)利用甲醛固定細胞核內的相互作用的染色質位點；(2)利用限制性內切酶將DNA切成片段狀；(3)再用DNA連接酶對片段末端進行連接，從而捕獲含有相互接觸DNA片段的文庫(即3C文庫)；(4)利用PCR或者測序的方法檢測文庫的DNA片段連接位點，獲得染色質不同位點相互接觸的頻率；(5)最后進行數據分析，推斷出染色質的空間位置信息，從而得到染色質相互作用位點的圖譜。

基于3C術的實驗分析只是關注于基因組中一對一位點的相互作用的研究(Dekkeretal.，2002)。后來在3C技術原理基礎上，又發展出了4C(circular chromosomeconformation capture，or chromosome conformation capture-onchip)技術(Simonisetal.，2006；Zhaoetal.，2006)，即環狀染色質構象捕獲技術或芯片染色質構象捕獲技術，4C技術的原理是在3C原理分析過程中，能夠通過連接酶連接DNA片段形成環狀連接，然后進行反向PCR(聚合酶鏈式反應)，最后對產物進行序列分析，可以獲得染色質中一對多的位點相互作用研究分析。

5C(chromosome conformation capture carbon copy)技術(Dostieetal.，2006)，也叫3C碳拷貝技術，它通過擴增連接介導產物增加3C技術對相互作用位點的檢測通量，從而實現多個位點對多個位點的相互作用研究分析。可以看出，這幾種技術都只能研究染色質中部分位點的相互作用，卻不能對整個基因組所有位點間進行無偏差的作用分析。