[發明專利]禽流感血凝抑制試驗檢測方法

在審

• 申請號: 201711268165.7
• 申請日: 2017-12-05
• 公開（公告）號: CN108088995A
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發明（設計）人: 王晟
• 申請（專利權）人: 廣西鳳翔集團股份有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 靳浩

1.一種禽流感血凝抑制試驗檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、取V形微量反應板，順序編號第1孔至第12孔，用微量移液器從第1孔至第11孔依次向各孔加入50μL4單位禽流感病毒抗原液；

S2、在第1孔及第12孔中分別加入50μL被檢血清，混合均勻后自第1孔開始吸50μL至第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，第10孔棄去50μL；

S3、從第12孔至第1孔依次向各孔加入50μL體積分數為1％的雞紅細胞懸液。

2.如權利要求1所述的禽流感血凝抑制試驗檢測方法，其特征在于，還包括：S4、將V形微量反應板置于微量振蕩器上振蕩1min，20-25℃靜置孵育20-40min，孵育期間，當第12孔中的紅細胞成明顯的紐扣狀沉到孔底時，判定其余各孔的凝集狀況，并得到被檢血清的血清效價。

3.如權利要求2所述的禽流感血凝抑制試驗檢測方法，其特征在于，步驟S4中的凝集情況包括不凝集、25％凝集、50％凝集、100％凝集，其中，以不凝集時的被檢血清的最大稀釋度為該被檢血清的HI滴度，即血清效價。

4.如權利要求2所述的禽流感血凝抑制試驗檢測方法，其特征在于，步驟S2中的4單位禽流感病毒抗原液的制備方法具體為：

a、另取V形微量反應板，順序編號第1孔至第12孔，用微量移液器從第1孔至第11孔依次向各孔加入50μL生理鹽水；

b、在第1孔加入50μL禽流感病毒液，混合均勻后，吸50μL至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，第11孔棄去50μL；

c、從第12孔至第1孔依次向各孔加入50μL體積分數為1％的雞紅細胞懸液；

d、將微量反應板置于微量振蕩器上振蕩1min，20-25℃靜置孵育20-40min，孵育期間，在第1孔至第12孔中出現紅細胞呈顆粒性傘狀凝集并沉于孔底的性狀時，以出現該性狀的所有孔所對應的禽流感病毒液的最大稀釋度為禽流感病毒液的血凝價，即一個凝集單位，從而計算出4個凝集單位對應的禽流感病毒液的稀釋度，根據4個凝集單位對應的禽流感病毒液的稀釋度配制4單位禽流感病毒抗原液。

5.如權利要求4所述的禽流感血凝抑制試驗檢測方法，其特征在于，步驟S1中、及步驟a中的V形微量反應板均為96孔V形微量反應板。

6.如權利要求1所述的禽流感血凝抑制試驗檢測方法，其特征在于，步驟S2中的被檢血清使用前置于56℃水浴中恒溫滅活30min。

7.如權利要求1所述的禽流感血凝抑制試驗檢測方法，其特征在于，步驟S3中雞紅細胞懸液通過以下方法獲得：首先采集5只SPF成年公雞的血液各0.5mL，并加入1mL抗凝劑混合均勻后，吸取2mL置于圓底離心管中，加入15mL質量分數為0.9％的生理鹽水進行一次離心，其時間為12min、轉速為1000r/min，棄去上清液，再加入15mL所述生理鹽水進行二次離心，其時間為8min、轉速為1500r/min，棄去上清液，再加入15mL所述生理鹽水進行三次離心，其時間為5min、轉速為1800r/min，棄去上清液，然后，加入8mL的PBS緩沖溶液離心后棄去上清液，反復進行三次，每次離心的時間為2min，轉速為500r/min，最后，吸取圓底離心管底部的紅細胞1mL，加入到99mL的PBS緩沖溶液中，輕微震蕩搖勻，得到體積分數為1％的雞紅細胞懸液，其中，所用的PBS緩沖溶液的pH為7.0。

8.如權利要求5所述的禽流感血凝抑制試驗檢測方法，其特征在于，步驟S1和步驟a中所用的96孔V形微量反應板在使用前均經過如下處理：將微量反應板先置于質量分數為1％的稀鹽酸中浸泡12h，取出經蒸餾水沖洗后，再依次置于質量分數為50％的乙醇中浸泡6h、蒸餾水中浸泡1h，取出后置于超聲波清洗機中超聲清洗，同時用紫外燈進行間歇性照射，最后烘干即可，其中，超聲波頻率為25～30KHz，時間為30min，紫外燈的波長為260nm，間歇性照射具體是照射時間為210s與停止照射時間為90s交替進行。