[發(fā)明專利]一種代謝物-蛋白質(zhì)相互作用體系篩選和表征方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711263776.2
• 申請日: 2017-12-05
• 公開（公告）號: CN109870516A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發(fā)明（設計）人: 許國旺;王博弘;秦倩;石先哲;常蒙蒙
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72;G01N30/34;G01N33/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發(fā)明公開了一種基于代謝組學及結(jié)構(gòu)質(zhì)譜技術(shù)的代謝物?蛋白質(zhì)相互作用體系篩選和表征方法，通過親和固載方法將異源表達的帶有標簽的靶標蛋白進行固定，再將其與代謝物提取物共同孵育，最后將靶標蛋白?代謝物復合物分離及變性洗脫后進行非靶向代謝組學分析，對比其與對照組(沒有固定蛋白的親和載體)差異，從而篩選出與靶標蛋白具有潛在相互作用的代謝物。繼而利用結(jié)構(gòu)質(zhì)譜對潛在相互作用體系進行直接驗證。該結(jié)合方法即能夠高通量篩選與靶標蛋白具有潛在相互作用代謝物，利用結(jié)構(gòu)質(zhì)譜的直接表征又能篩除間接表征過程中可能引入的假陽性互作結(jié)果。該方法是一種可靠的蛋白質(zhì)?代謝物相互作用高通量研究手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分析化學和生物化學領(lǐng)域，是一種結(jié)合代謝組學的間接篩選及結(jié)構(gòu)質(zhì)譜技術(shù)直接表征這兩種技術(shù)路線的代謝物-蛋白質(zhì)相互作用體系的高通量篩選和表征方法。

背景技術(shù)

內(nèi)源性代謝物小分子是胞內(nèi)分子化合物的主要成分，并且各種代謝物分子在胞內(nèi)濃度分布上具有較大差異。其所涉及的與多種多樣的蛋白質(zhì)的相互作用(無論是通過以產(chǎn)物/底物的形式參與酶促反應過程，或是以變構(gòu)輔因子/配體的形式變構(gòu)調(diào)控蛋白質(zhì))，已被證明可以控制生化反應中的物質(zhì)能量代謝并且能通過信號傳導來調(diào)節(jié)整個生理過程。因此，解析闡述生理條件下的代謝物-蛋白質(zhì)相互作用能夠揭示隱藏在疾病/健康狀態(tài)下的分子理論基礎，對于人類健康與醫(yī)藥發(fā)展至關(guān)重要。此外，疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)劑還可能為潛在的治療干預措施提供新的策略。

盡管研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)量可觀的代謝物-蛋白質(zhì)相互作用，但基于代謝體系的復雜性以及缺乏有效的表征手段，只有其中的一小部分所涉及的相互作用網(wǎng)絡被研究透徹。常見的用以表征代謝物-蛋白質(zhì)相互作用的研究手段包括熒光光譜法、表面等離子體共振、等溫滴定量熱法、核磁共振法等，但大多數(shù)這樣的研究手段均需要在分析之前對蛋白質(zhì)/配體進行標記、蛋白質(zhì)固載或者其他額外的操作，故而可能產(chǎn)生假陽性的代謝物-蛋白質(zhì)互作研究結(jié)果。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，高分辨質(zhì)譜逐漸成為了代謝物-蛋白質(zhì)相互作用的新型研究平臺。Saghatelian等在體外異源表達了靶標蛋白，利用代謝組學的手段篩選了與該蛋白可能具有相互作用的代謝物，但存在材料吸附過程中產(chǎn)生非特異性吸附從而引入假陽性結(jié)果的可能；Klassen等利用結(jié)構(gòu)質(zhì)譜技術(shù)能夠直接表征小分子-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并且能夠獲得相關(guān)的熱力學及動力學參數(shù)，但這種方法不能夠大批量的篩選與靶標蛋白具有相互作用的代謝物，僅僅適用較為簡單的研究體系。針對這樣的研究現(xiàn)狀，開發(fā)一種基于高分辨質(zhì)譜的代謝物-蛋白質(zhì)篩選和表征新方法很有必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有方法的不足，建立了結(jié)合代謝組學的間接篩選及結(jié)構(gòu)質(zhì)譜技術(shù)直接表征的代謝物-蛋白質(zhì)相互作用體系的高通量篩選和表征方法。該方法可在體外大批量篩選與靶標蛋白有潛在相互作用的代謝物，并利用結(jié)構(gòu)質(zhì)譜技術(shù)對潛在的代謝物-蛋白質(zhì)復合物進行直接表征，從而可靠性的表征代謝物-蛋白質(zhì)相互作用，為了解機體的生理過程及疾病的發(fā)生發(fā)展機制等提供依據(jù)。該方法具有檢測可靠性高、靈敏度好、通量大等優(yōu)點。

本發(fā)明采用的技術(shù)路線如下：

(1)在大腸桿菌中異源過量表達帶有組氨酸(His6-)標簽的靶標蛋白。利用超聲破碎儀對菌株進行破碎，破碎時間為30min。然后將蛋白裂解液與鎳離子樹脂共同孵育，利用His6-標簽蛋白與鎳離子樹脂之間的親和作用富集靶標蛋白。將鎳離子樹脂用含有20mM咪唑的緩沖液洗滌3-4次，再利用含有500mM的緩沖液對鎳離子樹脂進行洗脫從而得到靶標蛋白。