[發明專利]一種促進動物生長的融合基因及其表達載體

在審

• 申請號: 201711263603.0
• 申請日: 2017-12-05
• 公開（公告）號: CN107868793A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 張永亮;黃志鵬;習欠云;陳婷;孫加節;史合群
• 申請（專利權）人: 廣州市科虎生物技術研究開發中心;廣州市創唯曦旺生物科技有限公司;韶關市新科農生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 鄭州龍宇專利代理事務所(特殊普通合伙)41146
• 代理人: 韓松

技術領域

本發明屬于核酸藥物及畜牧養殖領域，具體公開了一種生長抑素基因與硫氧還蛋白基因的融合基因，以及由此構建的起到促進動物生長作用的表達載體。

技術背景

生長激素（Growth Hormone，GH）是腺垂體細胞分泌的蛋白質，是一種肽類激素，主要生理功能是促進神經組織以外所有其他組織的生長，對動物生產起著尤為重要的作用。生長激素分泌受生長激素釋放激素(Growth Hormone Releasing Factor，GHRF)和生長抑素(Somatostatin，SS)的雙向調控，前者促進GH釋放，后者則抑制GH釋放。若減少動物體內的生長抑素含量，理論上能促進GH的釋放，從而促進動物生長。

生長抑素14肽由于自身分子量較小，所以很難引起免疫反應，目前較有效的做法是將其與乙肝表面抗原融合成大分子，然而通過乙肝表面抗原增強免疫原性有引發過敏反應的潛在危險。Tacket等共對6名血清陰性和1名血清陽性的健康成人志愿者進行了2次乙型肝炎DN A疫苗接種和3次重組乙型肝炎疫苗接種，疫苗接種后幾分鐘內，在注射部位觀察到急性皮膚反應，112 天后，4名志愿者在3次重組疫苗接種后都出現了強抗體應答；麥艷冰等的報道也表明，臨床上有注射乙肝疫苗導致死亡的案例。

發明內容

針對上述問題，本發明提供了一種硫氧還蛋白基因TRX與生長抑素基因ss的融合基因，并在此基礎上構建了真核表達載體pVAX1-TRX-SS，注射該表達載體后，可顯著促進動物的生長，并明顯提高生長抑素基因疫苗的安全性。

為解決以上問題，本發明通過一下技術方案實現：

本發明設計一種融合基因TRX-SS，包含生長抑素基因與硫氧還蛋白基因，其制備方法包括以下步驟：以pET32a（+）中的TRX標記基因為模板，用帶有生長抑素14肽基因的引物進行擴增，PCR擴增完成后，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并按膠回收試劑盒說明進行膠回收，獲得406bp的融合基因，具體序列如SEQ ID NO.1所示，其中自5端354～395bp為SS基因插入，其余為TRX基因。

作為優選，正向引物包含Hind III酶切位點和起始密碼子序列，反向引物包含Xba I酶切位點、終止密碼子和生長抑素14肽基因序列。更優選的，所述正向引物序列為：5’-CCAAGCTTATGATGAGC-3’；所述反向引物序列為：5’- CCTCTAGACTAACAGGATG-3’。

作為優選，進行PCR擴增的反應體系為50 μL，包括：ddH₂O 11 μL，2×Tap Plus Master Mix 25 μL，pET32α（+） 5 ng/10 μL，正、反向引物各2 μL（10μmol/l）。

作為優選，進行PCR擴增的反應程序為：94℃變性2 min；94℃預變性1 min，62.5℃退火2 min，72℃延伸3 min，循環35次；72℃延伸7 min。

本發明還設計一種表達載體pVAX1-TRX-SS，包含上述融合基因，其構建方法包括以下步驟：分別用Hind III和Xba I限制性內切酶酶切上述融合基因和pVAX1質粒，37℃反應2 h；然后將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并按膠回收試劑盒說明進行膠回收（pVAX1質粒酶切后回收大小為2919bp的開環質粒，融合基因酶切后回收大小為400bp的基因片段）；將回收得到的開環質粒和融合基因按1:5的摩爾比于16℃連接過夜；將連接產物轉化E. coli DH5α，于含卡那霉素的固體培養基37℃培養過夜，次日挑取單克隆陽性菌，通過序列測定鑒定，得到表達載體pVAX1-TRX-SS。

作為優選，所述融合基因的酶切體系為：融合基因15 μL，Hind III 0.5 μL，Xba I 0.5 μL，10×M Buffer 2 μL，ddH₂O 2 μL。

作為優選，所述pVAX1質粒的酶切體系為：pVAX1質粒10 μL，Hind III 0.5 μL，Xba I 0.5 μL，10×M Buffer 2 μL，ddH₂O 7 μL。

本發明具有以下積極有益效果：

（1）硫氧還蛋白（TRX）是一類廣泛存在的熱穩定的作為氫載體的蛋白質(約12kDa)，在許多還原反應中作為氫供體，特別是核苷二磷酸變成相應的脫氧產物和光依賴性的還原反應中，也以結構域的形式出現于二硫鍵異構酶中，是一種安全的蛋白質，對動物和人沒有任何毒副作用。